توليد مزارع واجهة الهواء السائل للخلايا الظهارية الهوائية من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات
Summary
تسمح التطورات الحديثة في بروتوكولات تمايز الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان بالاشتقاق التدريجي لأنواع الخلايا الخاصة بالأعضاء. هنا ، نقدم خطوات مفصلة لصيانة وتوسيع الخلايا القاعدية للمجرى الهوائي المشتقة من iPSC وتمايزها إلى ظهارة مخاطية هدبية في ثقافات الواجهة الهوائية السائلة.
Abstract
أمراض مجرى الهواء الموصل مثل الربو والتليف الكيسي (CF) وخلل الحركة الهدبية الأولية (PCD) والتهابات الجهاز التنفسي الفيروسية هي الأسباب الرئيسية للاعتلال والوفيات في جميع أنحاء العالم. كانت المنصات المخبرية التي تستخدم الخلايا الظهارية القصبية البشرية (HBECs) مفيدة لفهمنا لظهارة مجرى الهواء في الصحة والمرض. يعد الوصول إلى HBECs من الأفراد المصابين بأمراض وراثية نادرة أو طفرات نادرة عنق الزجاجة في أبحاث الرئة.
يتم إنشاء الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) بسهولة عن طريق “إعادة برمجة” الخلايا الجسدية والاحتفاظ بالخلفية الجينية الفريدة للمتبرع الفردي. تسمح التطورات الحديثة بالتمايز الموجه ل iPSCs إلى الخلايا السلفية الظهارية الرئوية ، والخلايا السنخية من النوع 2 ، وكذلك خلايا ظهارة مجرى الهواء الموصلة عبر الخلايا القاعدية ، وهي الخلايا الجذعية الرئيسية في مجرى الهواء.
نوجز هنا بروتوكولا لصيانة وتوسيع الخلايا القاعدية للمجرى الهوائي المشتقة من iPSC (المشار إليها فيما يلي باسم iBCs) بالإضافة إلى تمايز النسب الثلاثي في مزارع الواجهة الهوائية السائلة (ALI). يتم الحفاظ على iBCs وتوسيعها ككرات ظهارية معلقة في قطرات من مصفوفة خارج الخلية مستزرعة في وسط خلية قاعدية أولية مكملة بمثبطات مسارات إشارات TGF-ß و BMP. تعبر iBCs داخل هذه المجالات الظهارية عن العلامات القاعدية الرئيسية TP63 و NGFR ، ويمكن تنقيتها عن طريق فرز الخلايا المنشط بالفلور (FACS) ، وعندما يتم طلاؤها على أغشية مسامية في ظروف زراعة ALI القياسية ، يتم تمييزها إلى ظهارة مجرى هوائي وظيفي. تتكون ثقافات ALI المستمدة من متبرعين أصحاء من خلايا قاعدية وإفرازية ومتعددة الأهداب وتظهر سلامة الحاجز الظهاري والأهداب المتحركة وإفراز المخاط. تلخص الثقافات المستمدة من الأفراد المصابين بالتليف الكيسي أو PCD نقل الكلوريد المختل وظيفيا بوساطة CFTR أو الأهداب غير المتحركة ، وهي العيوب الظهارية المسببة للأمراض.
هنا ، نقدم بروتوكولا لتوليد الخلايا البشرية التي يمكن تطبيقها لنمذجة وفهم أمراض مجرى الهواء.
Introduction
تمثل الأمراض الرئوية المزمنة عبئا كبيرا من المراضة والوفيات في جميع أنحاء العالم1. تمثل الحالات التي تؤثر على الشعب الهوائية الموصلة ، مثل الربو والتليف الكيسي (CF) وخلل الحركة الهدبي الأولي (PCD) والالتهابات الفيروسية أمراضا شائعة ونادرة ، مكتسبة ووراثية ، تساهم في هذا العبء العالمي. الوظائف الرئيسية للممرات الهوائية الموصلة هي: 1) تعمل كقناة للتدفق الرقائقي للهواء ، و 2) توفير إزالة الغشاء المخاطي الهدبي من مسببات الأمراض والحطام. تمثل الخلايا الإفرازية ومتعددة الأهداب والقاعدية أنواع الخلايا الظهارية الرئيسية في مجرى الهواء الموصل. تشمل أنواع الخلايا الظهارية النادرة الخلايا الأيونية وخلايا الخصلة والخلايا العصبية الصماوية ، وقد تمت مراجعتها في مكان آخر2.
على نطاق واسع ، كان العائق الرئيسي أمام فهم آليات المرض وتطوير النهج العلاجية هو النقص المستمر في الأنسجة الأولية البشرية لاستخدامها في النماذج قبل السريرية. تعتبر HBECs عموما المعيار الذهبي في النموذج المختبري للبيولوجيا الظهارية في مجرى الهواء البشري ولعبت أدوارا رئيسية في أبحاث التليف الكيسي على وجه الخصوص3. ومع ذلك ، عادة ما يتم عزلها إما من الخزعات بالمنظار القصبي ، أو من أنسجة الرئة بعد الجراحة ، أو من الرئتين المرفوضة لأغراض الزرع. إن الحصول على HBECs من الأفراد المصابين بأمراض وراثية ، بما في ذلك الأولويات البحثية ل CF و PCD ، أمر نادر الحدوث ولا يمكن التنبؤ به. هناك حاجة إلى التغلب على عنق الزجاجة هذا للخلايا الظهارية في مجرى الهواء المشتق من المريض. يتم إنشاء iPSCs بسهولة من أي فرد ، فهي تحتفظ بالخلفية الجينية الفريدة للمتبرع ، ولديها قدرة ملحوظة على التكاثر والبقاء على قيد الحياة على المدى الطويل في ظروف زراعة الخلايا4،5،6. من خلال تلخيص الخطوات الجنينية الرئيسية ، تخضع iPSCs “للتمايز الموجه” إلى أنواع الخلايا الخاصة بالأعضاء. لقد طورنا نحن وآخرون بروتوكولات لتوليد أسلاف الرئة المشتقة من iPSC ، والخلايا السنخية من النوع 27,8 وخلايا مجرى الهواء الموصل بما في ذلك الخلايا القاعدية في مجرى الهواء9,10,11,12.
الخلية القاعدية في مجرى الهواء هي الخلية الجذعية للمجرى الهوائي الموصل13. في عمل نشر سابقا ، قامت مجموعتنا بإنشاء خلايا ظهارية مشتقة من مجرى الهواء iPSC ، بما في ذلك مجموعة فرعية (iBCs) تعبر عن علامات الخلايا القاعدية الأساسية الأساسية بما في ذلك TP63 و KRT5 و NGFR. بعد إشارات من بيولوجيا الخلايا القاعدية البالغة ، يؤدي تثبيط مسارات SMAD المزدوجة (TGF-β و BMP) إلى زيادة تنظيم NGFR+ iBCs11,14. يتم إعادة تعليق NGFR+ iBCs كخلايا مفردة في قطرات من مصفوفة خارج الخلية ويتم زراعتها في وسط خلية قاعدية. أنها تجدد نفسها للحفاظ على السكان iBC وتشكيل كرويات ظهارية. ومع ذلك ، فإن نسبة ما تختلف أيضا إلى خلايا إفرازية بهذا التنسيق (يشار إليها باسم ثقافة 3-D). في البروتوكول التالي ، نقوم بتفصيل الخطوات اللازمة للحفاظ على هذه iBCs وتوسيعها في ثقافة 3-D ، بالإضافة إلى الخطوات المطلوبة لإنشاء ثقافة ALI المخاطية الهدبي 2-D وظيفية.
تم نشر الخطوات الأولية لبروتوكول التمايز هذا سابقا ولن تتم مراجعتها هنا11,12. ستركز هذه المخطوطة على توسيع وتنقية iBCs وتمييزها لاحقا إلى خلايا إفرازية وظيفية ومتعددة الأهداب في ثقافة ALI.
Protocol
Representative Results
Discussion
HBECs هي نوع الخلايا القياسي الذهبي لدراسة أمراض ظهارة مجرى الهواء. نظرا لقيودها (بما في ذلك إمكانية الوصول وصعوبة التلاعب وراثيا) ، قمنا بإنشاء بروتوكول لاشتقاق ثقافات iBCs و ALI. يمكن اشتقاق هذه الخلايا من أي متبرع والاحتفاظ بخلفيتها الجينية الفريدة ، مما يسمح بإجراء دراسات تنموية أساسية ونمذجة الأمراض والتطوير العلاجي الجديد.
في حين أن كل خطوة فردية من البروتوكول الموصوف ضرورية ، إلا أن هناك العديد منها يستحق المزيد من الذكر. أولا ، في كل خطوة تتطلب فصل الكرويات إلى خلايا واحدة ، من الأهمية بمكان تجنب السحب المفرط. الهضم الأنزيمي (مع dispase أو التربسين) يعزز بقاء الخلايا بشكل أفضل ، في حين أن السحب المفرط يؤدي إلى موت الخلايا بشكل كبير. ثانيا ، عند تنقية NGFR+ iBCs ، يعد استخدام التحكم في النمط المتماثل أمرا بالغ الأهمية ونوصي باختيار خلايا NGFR+ الأعلى تعبيرا باستخدام FACS (الشكل 3). ينتج عن هذا النهج ثقافات ALI المثلى مع التمايز المخاطي الهدبي المناسب. وأخيرا ، فإن إعداد وبذر الأغشية المسامية بدقة كما هو موثق في البروتوكول أمر أساسي لبقاء ثقافة ALI. في حين أننا عادة ما نزرع 30،000-60،000 خلية لكل إدراج ، فقد حققنا نجاحا مع عدد قليل يصل إلى 20،000 خلية. في حين يمكن إنشاء ثقافات ناجحة باستخدام طلاء المصفوفة المؤهل للخلايا الجذعية الجنينية البشرية ، فقد استخدمنا مؤخرا اللامينين المؤتلف البشري 521 مع متانة أعلى بكثير من ثقافات ALI.
نادرا جدا ، قد تفشل تمايزات iPSC في تنظيم نسبة كافية من NGFR + iBCs. في هذه الحالة ، يمكن أن يؤدي المرور التسلسلي ل iBCs (في ثقافة 3-D) إلى زيادة تردد NGFR بمرور الوقت. تتضمن قيود هذا البروتوكول الوقت والتكلفة والخبرة اللازمة لإنشاء هذه الخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، ندرك أن العديد من الباحثين مهتمون بأنواع الخلايا الأقل شيوعا في ظهارة مجرى الهواء (على سبيل المثال ، الخلايا الأيونية ، الخلايا العصبية الصماوية). في حين أننا اكتشفنا بعض هذه الأنواع من الخلايا النادرة ، كما هو الحال في مزارع HBEC الأولية ، إلا أنه لم يتم تحديدها بشكل متكرر ، على الأرجح بسبب عدم اكتمال المعرفة فيما يتعلق بالإشارات التنموية المطلوبة لتوليد هذه الخلايا.
كما هو مكتوب ، يبدأ البروتوكول أعلاه بذوبان iBCs المحفوظة بالفعل بالتبريد. تم وصف التفاصيل السابقة لهذا الحفظ بالتبريد سابقا وخارج نطاق هذه المخطوطة11,12.
تسمح طريقة زراعة ALI الظهارية في مجرى الهواء بتوليد خلايا ظهارية وظيفية في مجرى الهواء من أي متبرع تقريبا. هذا يزيد بشكل كبير من إمكانية الوصول إلى الخلايا الظهارية الثمينة التي يتم التحكم فيها وراثيا والتي يمكن استخدامها لنمذجة الأمراض ، وفحص الأدوية ، والعلاجات المستقبلية القائمة على الخلايا ، وكذلك لتحسين فهم النمط التنموي داخل ظهارة مجرى الهواء.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر أعضاء مختبرات هوكينز وكوتون وديفيس على مدخلاتهم المفيدة على مر السنين فيما يتعلق بهذا المشروع وغيره. نحن مدينون أيضا لبراين تيلتون (مدير فرز الخلايا في جامعة بوسطن) لتفانيه وخبرته التقنية ، ونحن ممتنون لجريج ميلر وماريان جيمس من مركز جامعة بوسطن للطب التجديدي (CReM) لدعمهما وخبرتهما الفنية في صيانة وتوصيف iPSCs الخاصة بالمريض ، بدعم من منح المعاهد الوطنية للصحة NO1 75N92020C00005 و U01TR001810. تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة U01HL148692 و U01HL134745 و U01HL134766 و R01HL095993 إلى D.N.K ، R01HL139876 إلى B.R.D ، R01 HL139799 إلى F.H. ، ومؤسسة التليف الكيسي (CFF) تمنح CFF 00987G220 و CFF WANG20GO إلى D.N.K ، CFF DAVIS15XX1 ، DAVIS17XX0 ، DAVIS19XX0 إلى B.R.D ، CFF SUZUKI19XX0 إلى S.S ، CFF BERICA2010 إلى A.B. ، و CFF HAWKIN20XX2 إلى F.H.
Materials
| 12-well tissue culture treated plate | Corning | 3515 | flat bottom |
| 3-D growth factor reduced Matrigel | Corning | 356230 | |
| A83-01 | ThermoFisher Scientific | 293910 | |
| Cell culture inserts (Transwell) | Corning | 3470 | 6.5mm diameter; 0.4μm pore size |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D8418 | |
| Dispase II, Powder | ThermoFisher Scientific | 17105-041 | |
| DMH1 | ThermoFisher Scientific | 412610 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture (DMEM):F-12 | ThermoFisher Scientific | 11330-032 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) (1X) | Gibco | 14190-144 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt solution (EDTA) | Sigma | E7889 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher | SH3007003E | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14175-079 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| hESC-qualified Matrigel | Corning | 354277 | |
| Mouse IgG1kappa isotype control, APC-conjugated | Biolegend | 400122 | |
| Mouse monoclonal anti-human CD271/NGFR, APC-conjugated | Biolegend | 345108 | |
| PneumaCult-ALI Medium (ALI Differentiation Medium) | StemCell Technologies | 05001 | |
| PneumaCult-Ex Plus Medium (Basal Cell Base Medium) | StemCell Technologies | 05040 | |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-2 | |
| rhLaminin-521 | ThermoFisher Scientific | A29248 | Final Concentration: 10ug/mL |
| Trypsin-EDTA Solution, 0.05% | Invitrogen | T3924 | |
| Y-27632 | Tocris | 1254 |
References
- GBD Chronic Respiratory Disease Collaborators. Prevalence and attributable health burden of chronic respiratory diseases, 1990-2017: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. The Lancet. Respiratory Medicine. 8 (6), 585-596 (2020).
- Alysandratos, K. -. D., Herriges, M. J., Kotton, D. N. Epithelial stem and progenitor cells in lung repair and regeneration. Annual Review of Physiology. 83, 529-550 (2021).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods in Molecular Medicine. 107, 183-206 (2005).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Berical, A., Lee, R. E., Randell, S. H., Hawkins, F. Challenges facing airway epithelial cell-based therapy for cystic fibrosis. Frontiers in Pharmacology. 10, 74 (2019).
- Jacob, A., et al. Derivation of self-renewing lung alveolar epithelial type II cells from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 14 (12), 3303-3332 (2019).
- Gotoh, S., et al. Generation of alveolar epithelial spheroids via isolated progenitor cells from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3 (3), 394-403 (2014).
- Huang, S. X. L., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2013).
- Mou, H., et al. Generation of multipotent lung and airway progenitors from mouse ESCs and patient-specific cystic fibrosis iPSCs. Cell Stem Cell. 10 (4), 385-397 (2012).
- Hawkins, F. J., et al. Derivation of airway basal stem cells from human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 28 (1), 79-95 (2021).
- Suzuki, S., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into functional airway basal stem cells. STAR Protocols. 2 (3), 100683 (2021).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
- Mou, H., et al. Dual SMAD signaling inhibition enables long-term expansion of diverse epithelial basal cells. Cell Stem Cell. 19 (2), 217-231 (2016).
