Generazione di colture di interfaccia aria-liquido di cellule epiteliali delle vie aeree da cellule staminali pluripotenti umane

Ciascuno dei seguenti passaggi deve essere eseguito utilizzando una tecnica sterile in una cappa a flusso laminare di livello di biosicurezza 2. Tutti i fluidi devono essere riscaldati a temperatura ambiente (22 °C) prima di essere aggiunti alle celle, salvo quando espressamente indicato diversamente. Ogni fase di centrifugazione deve essere eseguita a temperatura ambiente (circa 22 °C). Nella Figura 1 vengono illustrati gli schemi del protocollo. 1. Preparazione dei supporti richiesti NOTA: vedere il file supplementare 1 per i dettagli. Mezzo cellulare basale Preparare il supporto di base secondo le istruzioni del produttore. Per ogni 50 mL del mezzo di base, aggiungere 5 μL di A83-01 (10 mM), 5 μL di DMH1 (10 mM), 50 μL di Y-27632 (10mM) e 100 μL di Primocin (50 mg/mL). Di seguito, questo mezzo è chiamato mezzo cellulare basale. Conservare a 4 °C per un massimo di 1 mese. Mezzo di differenziazione ALI Preparare il mezzo secondo le istruzioni del produttore. Ad ogni 50 mL di mezzo di differenziazione ALI, aggiungere 100 μL di Primocin (50 mg/mL). Conservare al riparo dalla luce a 4 °C per un massimo di 1 mese. Buffer di ordinamento Per ogni 50 mL di Sort Buffer, combinare 47,5 mL di soluzione salina bilanciata di Hanks, 1 mL di FBS, 200 μL di EDTA (500 mM), 1,25 mL di HEPES Buffer (1 M), 50 μL di Y-27632 (10 mM) e 100 μL di Primocin (50 mg/mL). Filtrare sterilizzare utilizzando una dimensione dei pori di 0,4 μm. Conservare a 4 °C per un massimo di 1 mese. Crioconservazione Media Per ogni 50 mL di mezzo di crioconservazione, combinare 45 mL di mezzo cellulare basale e 5 mL di dimetilsolfossido (DMSO). Filtrare sterilizzare utilizzando una dimensione dei pori di 0,4 μm. Conservare a 4 °C per un massimo di 1 mese. 2. Scongelamento di iBC crioconservati Scongelare (su ghiaccio) un volume sufficiente di fattore di crescita 3D ha ridotto la matrice extracellulare (di seguito matrice 3D). Tenere sul ghiaccio fino al momento dell’uso.NOTA: Quando si scongela un flaconcino (contenente 250.000 cellule), scongelare 100-200 μL di matrice 3D. Scongelare un flaconcino di sospensioni unicellulari di iBC precedentemente crioconservate incubando in un bagno di acqua o perline a 37 °C solo fino a quando non vi è alcun mezzo congelato visibile (1-2 min). Utilizzando una pipetta sierologica da 5 ml, aggiungere la sospensione cellulare a un tubo conico da 15 ml. Aggiungere 6-10 mL di DMEM/F12 a goccia alla sospensione cellulare, mescolare delicatamente e centrifugare a 300 x g per 5 minuti per pellettizzare le celle. Aspirare il surnatante e risospescere il pellet cellulare in 1 mL di basal cell medium con una micropipetta P1000. Rimuovere un’aliquota di 10 μL ed eseguire un conteggio delle cellule. Centrifugare le celle a 300 x g per 5 min. Aspirare il surnatante e risospese le cellule ad una densità di 4.000 cellule/μL in matrice 3D precedentemente scongelata con una micropipetta P1000.NOTA: è fondamentale evitare di aggiungere bolle alla matrice 3D. Pipettare la matrice lentamente e con attenzione. Con una micropipetta P200, aggiungere una goccia (25 o 50 μL) alla base di ciascun pozzetto di una piastra trattata con coltura tissutale a 12 pozzetti. Se si inizia con 250.000 cellule congelate, il numero previsto di goccioline in questa fase è compreso tra 3-4 (25 μL di goccioline), a seconda della vitalità cellulare. Incubare la piastra a 37 °C per circa 15 minuti, quindi aggiungere abbastanza basale medium a ciascun pozzetto per immergere completamente la goccia (1,5 mL per 50 μL; 1 mL per 25 μL), usando una pipetta sierologica da 5 mL. Riportare la piastra in un incubatore umidificato. Nutrire le cellule ogni 2 giorni usando il mezzo cellulare basale fresco. Aggiungere il mezzo fresco sul lato del pozzo con una pipetta sierologica da 5 ml, facendo attenzione a non disturbare la goccia di cellule.NOTA: La densità delle cellule placcate in questa fase è 10 volte superiore al passaggio di routine degli iBC nella sezione 3. 3. Dissociazione degli sferoidi ed espansione degli iBC in coltura 3D Scongelare (su ghiaccio) un volume sufficiente di matrice 3D. Tenere sul ghiaccio fino al momento dell’uso.NOTA: il volume della matrice 3D richiesta varia in base al numero di celle richieste dall’utente. Circa 5-7 giorni dopo, aspirare il mezzo da ciascun pozzetto e con una micropipetta P1000, aggiungere 1 mL di Dispase II (1 U/mL) direttamente sugli sferoidi per dissociarsi dalla goccia della matrice. Posizionare la piastra in un’incubatrice a 37 °C per 10-15 minuti. Utilizzando una micropipetta P1000, pipettare il Dispase su e giù 1-2 volte, rompendo grandi grumi di matrice 3D. Riportare la piastra a 37 °C per altri 30-40 minuti, permettendo alla matrice di dissolversi completamente. Quando la goccia di matrice 3D non è più visibile al microscopio ottico, aggiungere gli sferoidi liberamente fluttuanti a una conica da 15 ml utilizzando una punta della pipetta sierologica da 5 ml. Aggiungere DMEM/F12 per un volume finale di 10 ml per conica e centrifuga a 200 x g per 3 minuti per pellettizzare gli sferoidi. Aspirare il surnatante e aggiungere 1 mL di tripsina allo 0,05% (37 °C) per ogni goccia iniziale dissociata (ad esempio, se si inizia con quattro goccioline, aggiungere 4 ml di tripsina al matraccio conico). Incubare a 37 °C, triturando frequentemente (ogni 2-3 min). Valutare con il microscopio ottico ogni pochi minuti. Una volta che la maggior parte (>90%) degli sferoidi sono stati dissociati a singole cellule, aggiungere il 10% di siero bovino fetale (in DMEM / F12) con un rapporto di volume 1: 1 alla tripsina. Filtrare le cellule attraverso un filtro cellulare da 40 μm e centrifugare a 300 x g per 5 min. Eseguire un conteggio delle cellule e risospese uniformemente le cellule ad una densità di 400 celle / μL di matrice 3D scongelata. Evitare di introdurre bolle d’aria. Risospesciare tutte le goccioline necessarie per l’applicazione a valle. Ripetere i passaggi 2.6-2.9 per ogni pozzetto. 4. Valutazione e purificazione di iBC NGFR+ Dopo 10-14 giorni dal passaggio più recente, dissociare gli sferoidi in una sospensione a singola cellula come nei passaggi 3.2-3.5 ed eseguire un conteggio cellulare.NOTA: linee iPSC diverse si comportano in modo diverso; pertanto, l’intervallo di 10-14 giorni può variare per diversi iBC. Fare riferimento alla Figura 2 per le apparizioni tipiche degli iBC 3D dopo 1, 4, 8 e 14 giorni, quando sono adeguate per l’ordinamento delle cellule NGFR+. L’ordinamento prima di quanto raccomandato (ad esempio, il giorno 8 come nella Figura 2C), si traduce in un numero complessivo di cellule inferiore con un’espressione NGFR meno frequente. L’ordinamento più tardi di quanto raccomandato (ad esempio, più di 14 giorni dopo il passaggio più recente) porta a una scarsa sopravvivenza cellulare post-ordinamento. Risospesso le celle ad una densità di 1 x 106 celle/100 μL in Sort Buffer (popolazione principale). Trasferire una piccola aliquota (25-50 μL) in un tubo separato (popolazione minore). Aggiungere l’anticorpo anti-NGFR coniugato (diluizione 1:100) alla popolazione cellulare principale. Aggiungere l’anticorpo di controllo dell’isotipo (diluizione 1:200) alla popolazione cellulare minore. Proteggere le cellule dalla luce e tenere sul ghiaccio per 30 minuti, a intermittenza (ogni 5-10 min) triturando le celle per evitare la pellettizzazione. Dopo 30 minuti, aggiungere il buffer di ordinamento in un rapporto 1:1 a ciascun tubo di celle. Centrifugare le celle a 300 x g per 5 min. Aspirare il surnatante, risospesciare le celle pellettate nel Sort Buffer ad una densità di 10 x 106 celle/ml e aggiungere macchie di cellule vive o morte. Utilizzando un’appropriata strategia di gating NGFR+ (basata sul controllo dell’isotipo, vedere la Figura 3), ordinare abbastanza celle NGFR+ vive per le necessarie applicazioni a valle.NOTA: Se si utilizzano iBC con reporter fluorescenti (ad esempio, NKX2-1GFP TP63tdTomato), si consiglia di ordinare per celle “triple positive” (ad esempio, NKX2-1GFP +, TP63tdTomato +, NGFR +), con selezione e compensazione del gate appropriate (Figura 3). Durante questa espansione di iBC, una percentuale di cellule si differenzia in cellule secretorie e può anche essere rilevata una percentuale molto piccola di cellule multiciliate. Entrambe queste popolazioni sono NGFR-. 5. Generazione di colture ALI mucociliarie Preparare inserti di membrana porosa da 6,5 mm aggiungendo una matrice da 200 μL alla camera apicale (matrice qualificata con cellule staminali embrionali umane o laminina umana ricombinante-521) secondo le istruzioni del produttore. Porre a 37 °C per almeno 2 ore prima del necessario. Aspirare la matrice di rivestimento dalla camera apicale dell’inserto. Aggiungere 500 μL del mezzo cellulare basale alla camera basolaterale. Sospendere almeno 30.000 cellule NGFR+ selezionate (dal passo 4.5) in 100-200 μL basal cell medium e trasferirle nella camera apicale utilizzando una micropipetta P200. Ripetere l’operazione per tutti i pozzetti desiderati (e le celle disponibili). Posizionare la piastra in un incubatore umidificato a 37 °C. In 2-3 giorni, aspirare le camere apicali e basolaterali e alimentare con mezzo cellulare basale fresco (da 500 μL a apicale, da 100 μL a basolaterale). Monitorare quotidianamente la camera apicale con la microscopia ottica. Quando le cellule sono >80% confluenti (in genere 3-7 giorni), sostituire il mezzo cellulare basale con il mezzo di differenziazione ALI (non preriscaldato) in entrambe le camere apicali e basolaterali. Quando si lavora con ALI Differentiation Medium, proteggere dalla luce mantenendo i contenitori dei supporti avvolti in un foglio e spegnendo le luci a soffitto quando possibile. Il giorno dopo, aspirare il mezzo dalla camera apicale, esponendo così la superficie apicale all’aria. Sostituire il mezzo di differenziazione ALI nella camera basolaterale ogni 2-3 giorni. Monitorare l’aspetto della coltura ogni 1-2 giorni. Aspirare accuratamente qualsiasi liquido accumulato dalla camera apicale, senza disturbare lo strato cellulare. Valutare la resistenza elettrica transepiteliale (TEER) per l’integrità epiteliale.NOTA: TEER può essere valutato nei giorni successivi all’esposizione all’aria per dare una lettura dell’integrità dello strato epiteliale. Il tempo ideale per misurare TEER non è stato stabilito, anche se i valori coerenti con la differenziazione mucociliare di alta qualità sono in genere >500 x cm2. Se è necessario rimuovere detriti o muco, aggiungere delicatamente 100 μL PBS (senza Ca2+ o Mg2+) alla camera apicale. Incubare a 37 °C per 10 minuti, quindi aspirare accuratamente PBS. Dopo 7-10 giorni di esposizione all’aria, le ciglia mobili appaiono tipicamente e possono essere viste usando la microscopia ottica. A seconda dell’esperimento pianificato e della lettura, le cellule possono essere analizzate dopo 14-28 giorni di esposizione all’aria.NOTA: se sono state utilizzate cellule reporter fluorescenti e se è disponibile un microscopio fluorescente a cellule vive, le cellule possono essere tracciate con microscopia ottica e fluorescenza reporter. 6. Crioconservazione facoltativa (ma consigliata) di iBC Dopo 10-14 giorni dall’ultimo passaggio della coltura 3D, dissociare gli sferoidi in sospensione unicellulare come nei passaggi 3.2-3.5. Eseguire un conteggio delle celle. Risospendo in mezzo di crioconservazione ad una densità di 250.000 cellule/500 μL in una crioviale. Posizionare i crioviali in un contenitore per garantire un calo costante della temperatura (1 °C/min) e trasferirli a -80 °C per 24-48 ore, seguiti da trasferimento a -150 °C per la conservazione a lungo termine.NOTA: Sono state eseguite la crioconservazione ripetuta e la crioconservazione di cellule precedentemente selezionate con NGFR+, ma queste non sono state adeguatamente valutate per la vitalità cellulare e la capacità di formare colture ALI funzionali. Soprattutto con il passaggio cellulare esteso, si raccomanda di valutare il cariotipo in quanto è stato notato che questo varia nelle iPSC e nelle cellule derivate da iPSC.