İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Hava Yolu Epitel Hücresi Hava-Sıvı Arayüz Kültürlerinin Oluşturulması

Aşağıdaki adımların her biri, biyogüvenlik seviye 2 laminer akış başlığında steril teknik kullanılarak gerçekleştirilmelidir. Tüm ortamlar, özellikle aksi belirtilmedikçe, hücrelere eklenmeden önce oda sıcaklığına (22 ° C) ısıtılmalıdır. Her santrifüjleme adımı oda sıcaklığında (yaklaşık 22 °C) gerçekleştirilmelidir. Şekil 1 , protokolün şemalarını özetlemektedir. 1. Gerekli ortamların hazırlanması NOT: Ayrıntılar için Ek Dosya 1’e bakın. Bazal Hücre Ortamı Baz ortamını üreticinin talimatlarına göre hazırlayın. Baz ortamın her 50 mL’sine 5 μL A83-01 (10 mM), 5 μL DMH1 (10 mM), 50 μL Y-27632 (10mM) ve 100 μL Primosin (50 mg / mL) ekleyin. Bundan böyle bu ortam bazal hücre ortamı olarak adlandırılacaktır. 4 °C’de 1 aya kadar saklayın. ALI Farklılaşma Ortamı Ortamı üreticinin talimatlarına göre hazırlayın. Her 50 mL’lik ALI Farklılaşma Ortamına 100 μL Primosin (50 mg / mL) ekleyin. 1 aya kadar 4 °C’de ışıktan korunarak saklayın. Arabelleği Sırala Her 50 mL Sıralama Tamponu için, 47,5 mL Hanks Dengeli Tuz Çözeltisi, 1 mL FBS, 200 μL EDTA (500 mM), 1,25 mL HEPES Tamponu (1 M), 50 μL Y-27632 (10 mM) ve 100 μL Primosin (50 mg/mL) birleştirin. 0,4 μm gözenek boyutu kullanarak filtre sterilizasyonu. 4 °C’de 1 aya kadar saklayın. Kriyoprezervasyon Ortamı Her 50 mL Kriyoprezervasyon Ortamı için, 45 mL Bazal Hücre Ortamı ve 5 mL dimetil sülfoksit (DMSO) birleştirin. 0,4 μm gözenek boyutu kullanarak filtre sterilizasyonu. 4 °C’de 1 aya kadar saklayın. 2. Kriyokorunmuş iBC’lerin çözülmesi Yeterli hacimde 3-D büyüme faktörü hücre dışı matrisi (bundan böyle 3-D matris olarak anılacaktır) çözdürmek (buz üzerinde). Kullanıma hazır olana kadar buz üzerinde tutun.NOT: Bir şişeyi çözerken (250.000 hücre içeren), 100-200 μL 3-D matrisi çözün. iBC’lerin daha önce kriyokorunmuş tek hücreli süspansiyonlarından oluşan bir şişeyi, görünür donmuş ortam kalmayana kadar (1-2 dakika) 37 ° C’lik bir su veya boncuk banyosunda inkübe ederek çözün. 5 mL’lik bir serolojik pipet kullanarak, 15 mL’lik bir konik tüpe hücre süspansiyonu ekleyin. Hücre süspansiyonuna damla damla 6-10 mL DMEM / F12 ekleyin, hafifçe karıştırın ve hücreleri peletlemek için 5 dakika boyunca 300 x g’de santrifüj yapın. Süpernatantı aspire edin ve hücre peletini bir P1000 mikropipet ile 1 mL Bazal Hücre Ortamında yeniden askıya alın. 10 μL’lik bir aliquot’u çıkarın ve bir hücre sayımı gerçekleştirin. Hücreleri 5 dakika boyunca 300 x g’de santrifüj yapın. Süpernatantı aspire edin ve hücreleri bir P1000 mikropipet ile daha önce çözülmüş 3-D matriste 4.000 hücre / μL yoğunluğunda yeniden askıya alın.NOT: 3B matrise kabarcık eklemekten kaçınmak çok önemlidir. Matrisi yavaşça ve dikkatlice pipetleyin. Bir P200 mikropipet ile, 12 delikli doku kültürü ile muamele edilmiş bir plakanın her bir kuyucuğunun tabanına bir damlacık (25 veya 50 μL) ekleyin. 250.000 dondurulmuş hücreyle başlıyorsa, bu adımda beklenen damlacık sayısı, hücre canlılığına bağlı olarak 3-4 (25 μL damlacık) arasındadır. Plakayı yaklaşık 15 dakika boyunca 37 ° C’de inkübe edin ve ardından 5 mL’lik bir serolojik pipet kullanarak damlacığı tamamen batırmak için her bir kuyucuğa yeterli Bazal Hücre Ortamı ekleyin (50 μL için 1,5 mL; 25 μL için 1 mL). Plakayı nemlendirilmiş bir inkübatöre geri koyun. Taze Bazal Hücre Ortamı kullanarak hücreleri her 2 günde bir besleyin. Hücre damlacığını rahatsız etmemeye özen göstererek 5 mL serolojik pipet ile kuyunun kenarına taze ortam ekleyin.NOT: Bu aşamada kaplanan hücrelerin yoğunluğu, bölüm 3’teki iBC’lerin rutin geçişinden 10 kat daha yüksektir. 3. Sferoidlerin ayrışması ve iBC’lerin 3-D kültürde genişlemesi Yeterli miktarda 3 boyutlu matrisi (buz üzerinde) çözün. Kullanıma hazır olana kadar buz üzerinde tutun.NOT: Gerekli 3B matrisin hacmi, kullanıcının kaç hücreye ihtiyaç duyacağına bağlı olarak değişir. Yaklaşık 5-7 gün sonra, ortamı her bir kuyucuktan aspire edin ve bir P1000 mikropipet ile, matrisin damlacığından ayrışmak için doğrudan sferoidlerin üzerine 1 mL Dispase II (1 U / mL) ekleyin. Plakayı 10-15 dakika boyunca 37 °C inkübatöre yerleştirin. Bir P1000 mikropipet kullanarak, Dispase’ı 1-2 kez yukarı ve aşağı pipetle pipetleyin ve 3-D matrisin büyük kümelerini parçalayın. Plakayı 30-40 dakika daha 37 ° C’ye geri döndürün ve matrisin tamamen çözünmesine izin verin. 3-D matrisin damlacığı artık ışık mikroskobu altında görünmediğinde, serbestçe yüzen sferoidleri 5 mL’lik bir serolojik pipet ucu kullanarak 15 mL’lik bir koniğe ekleyin. Konik başına 10 mL’lik son hacim için DMEM/F12 ekleyin ve sferoidleri peletlemek için 3 dakika boyunca 200 x g’de santrifüj yapın. Süpernatantı aspire edin ve ayrışmış her ilk damlacık için 1 mL% 0.05 tripsin (37 ° C) ekleyin (örneğin, dört damlacıkla başlıyorsa, konik şişeye 4 mL tripsin ekleyin). 37 ° C’de inkübe edin, sık sık tritüre edin (her 2-3 dakikada bir). Birkaç dakikada bir ışık mikroskobu ile değerlendirin. Sferoidlerin çoğunluğu (>% 90) tek hücrelere ayrıldıktan sonra, tripsine 1: 1 hacim oranında% 10 Fetal Sığır Serumu (DMEM / F12’de) ekleyin. Hücreleri 40 μm’lik bir hücre süzgecinden süzün ve 5 dakika boyunca 300 x g’de santrifüj yapın. Bir hücre sayımı yapın ve hücreleri 400 hücre/μL çözülmüş 3B matris yoğunluğunda eşit şekilde yeniden askıya alın. Hava kabarcıkları sokmaktan kaçının. Aşağı akış uygulaması için gerektiği kadar damlacığı yeniden askıya alın. Her kuyucuk için adım 2.6-2.9’u tekrarlayın. 4. NGFR+ iBC’lerin değerlendirilmesi ve saflaştırılması En son geçişten 10-14 gün sonra, sferoidleri 3.2-3.5 adımlarında olduğu gibi tek bir hücre süspansiyonuna ayırın ve bir hücre sayımı yapın.NOT: Farklı iPSC hatları farklı davranır; bu nedenle, 10-14 gün aralığı farklı iBC’ler için değişebilir. 3-B iBC’lerin 1, 4, 8 ve 14 gün sonra, NGFR+ hücre sıralaması için yeterli olduklarında tipik görünümleri için lütfen Şekil 2’ye bakın. Önerilenden daha erken sıralama (örneğin, Şekil 2C’deki gibi 8. gün), daha az sıklıkta NGFR ifadesine sahip genel olarak daha düşük bir hücre sayısıyla sonuçlanır. Önerilenden daha geç sıralama (örneğin, en son geçişten sonra 14 günden fazla), sıralama sonrası hücre sağkalımının zayıf olmasına yol açar. Hücreleri Sıralama Tamponunda (ana popülasyon) 1 x 106 hücre / 100 μL yoğunluğunda yeniden askıya alın. Küçük bir aliquot’u (25-50 μL) ayrı bir tüpe (küçük popülasyon) aktarın. Ana hücre popülasyonuna konjuge anti-NGFR antikoru (1:100 seyreltme) ekleyin. Minör hücre popülasyonuna izotip kontrol antikoru (1:200 seyreltme) ekleyin. Hücreleri ışıktan koruyun ve 30 dakika boyunca buz üzerinde tutun, peletlenmeyi önlemek için hücreleri aralıklı olarak (her 5-10 dakikada bir) tritüre edin. 30 dakika sonra, Sıralama Arabelleğini her hücre tüpüne 1: 1 oranında ekleyin. Hücreleri 5 dakika boyunca 300 x g’da santrifüj yapın. Süper nantantı aspire edin, Sıralama Tamponundaki peletlenmiş hücreleri 10 x 106 hücre / mL yoğunlukta yeniden askıya alın ve canlı veya ölü hücre boyası ekleyin. Uygun NGFR+ geçit stratejisini kullanarak (izotip kontrolüne dayanarak, bkz. Şekil 3), gerekli aşağı akış uygulamaları için yeterli sayıda canlı NGFR+ hücresini sıralayın.NOT: Floresan muhabirlerle (yani, NKX2-1 GFP TP63 tdTomato) iBC’ler kullanılıyorsa, uygun kapı seçimi ve telafisi ile “üçlü pozitif” hücreler (yani, NKX2-1GFP +, TP63 tdTomato +, NGFR +) için sıralama yapılması önerilir (Şekil 3). iBC’lerin bu genişlemesi sırasında, hücrelerin bir kısmı salgı hücrelerine farklılaşır ve çok uluslu hücrelerin çok küçük bir kısmı da tespit edilebilir. Bu popülasyonların her ikisi de NGFR-‘dir. 5. Mukosiliyer ALI kültürlerinin oluşturulması Apikal odaya 200 μL’lik bir matris ekleyerek (insan embriyonik kök hücre nitelikli matris veya rekombinant insan laminin-521) üreticinin talimatına göre 6,5 mm gözenekli membran ekleri hazırlayın. Gerekmeden önce en az 2 saat boyunca 37 ° C’de yerleştirin. Kaplama matrisini kesici ucun apikal odasından aspire edin. Bazolateral odaya 500 μL Bazal Hücre Ortamı ekleyin. 100-200 μL Bazal Hücre Ortamında en az 30.000 sıralanmış NGFR+ hücresini (adım 4.5’ten itibaren) yeniden askıya alın ve bir P200 mikropipeti kullanarak apikal odaya aktarın. İstediğiniz kadar kuyu (ve mevcut hücreler) için tekrarlayın. Plakayı nemlendirilmiş 37 °C inkübatöre yerleştirin. 2-3 gün içinde, apikal ve bazolateral odaları aspire edin ve taze Bazal Hücre Ortamı (apikal için 500 μL, bazolateral için 100 μL) ile besleyin. Işık mikroskobu ile apikal odacığı günlük olarak izleyin. Hücreler% >80 oranında aktığında (tipik olarak 3-7 gün), Bazal Hücre Ortamını hem apikal hem de bazolateral odalarda ALI Farklılaşma Ortamı (önceden ısıtılmamış) ile değiştirin. ALI Differentiation Medium ile çalışırken, ortam kaplarını folyoya sarılmış halde tutarak ve mümkün olduğunda tepe lambalarını kapatarak ışıktan koruyun. Ertesi gün, ortamı apikal odadan aspire edin, böylece apikal yüzeyi havaya maruz bırakın. Bazolateral odadaki ALI Farklılaşma Ortamı ortamını her 2-3 günde bir değiştirin. Kültür görünümünü her 1-2 günde bir izleyin. Biriken herhangi bir sıvıyı, hücre tabakasını bozmadan, apikal odadan dikkatlice aspire edin. Epitel bütünlüğü için transepitelyal elektrik direncini (TEER) değerlendirin.NOT: TEER, epitel tabakası bütünlüğünün bir okumasını vermek için havaya maruz kalmayı takip eden günlerde değerlendirilebilir. TEER’i ölçmek için ideal zaman belirlenmemiştir, ancak yüksek kaliteli mukosiliyer farklılaşma ile tutarlı değerler tipik olarak >500 xcm2’dir. Enkaz veya mukusun çıkarılması gerekiyorsa, apikal odaya nazikçe 100 μL PBS (Ca 2 + veya Mg2 + olmadan) ekleyin. 10 dakika boyunca 37 ° C’de inkübe edin ve ardından PBS’yi dikkatlice aspire edin. 7-10 gün havaya maruz kaldıktan sonra, hareketli kirpikler tipik olarak ortaya çıkar ve ışık mikroskobu kullanılarak görülebilir. Planlanan deneye ve okumaya bağlı olarak, hücreler 14-28 gün havaya maruz kaldıktan sonra analiz edilebilir.NOT: Floresan muhabir hücreler kullanılmışsa ve canlı hücre floresan mikroskobu mevcutsa, hücreler muhabir floresansının yanı sıra ışık mikroskobu ile de izlenebilir. 6. iBC’lerin isteğe bağlı (ancak önerilen) kriyoprezervasyonu. En son 3-B kültür geçişinden 10-14 gün sonra, sferoidleri 3.2-3.5 adımlarında olduğu gibi tek hücreli süspansiyona ayırın. Bir hücre sayımı gerçekleştirin. Kriyoprezervasyon Ortamında bir kriyovyalde 250.000 hücre / 500 μL yoğunlukta yeniden askıya alın. Sıcaklıkta (1 ° C / dak) sabit bir düşüş sağlamak için kriyovalleri bir kaba koyun ve 24-48 saat boyunca -80 ° C’ye aktarın, ardından uzun süreli depolama için -150 ° C’ye aktarın.NOT: Daha önce NGFR + sıralanmış hücrelerin kriyoprezervasyonunun yanı sıra tekrar kriyoprezervasyon da yapılmıştır, ancak bunlar hücre canlılığı ve fonksiyonel ALI kültürleri oluşturma yeteneği açısından yeterince değerlendirilmemiştir. Özellikle genişletilmiş hücre geçişi ile, iPSC’lerde ve iPSC türevi hücrelerde değiştiği belirtildiğinden, karyotip için değerlendirme yapılması önerilir.