Geração de culturas de interface ar-líquido de células epiteliais das vias aéreas a partir de células-tronco pluripotentes humanas

Cada uma das etapas a seguir deve ser realizada utilizando técnica estéril em uma capa de fluxo laminar nível 2 de biossegurança. Todas as mídias devem ser aquecidas à temperatura ambiente (22 °C) antes de serem adicionadas às células, exceto quando especificamente mencionadas de outra forma. Cada passo de centrifugação deve ser realizado à temperatura ambiente (aproximadamente 22 °C). A Figura 1 descreve os esquemas do protocolo. 1. Preparação de mídia necessária NOTA: Consulte o arquivo suplementar 1 para obter detalhes. Meio de célula basal Prepare o meio base de acordo com as instruções do fabricante. A cada 50 mL do meio base, adicione 5 μL de A83-01 (10 mM), 5 μL de DMH1 (10 mM), 50 μL de Y-27632 (10mM) e 100 μL de Primocin (50 mg/mL). Daqui em diante, esta mídia é chamada de meio de célula basal. Armazene a 4 °C por até 1 mês. Meio de Diferenciação ALI Prepare o meio de acordo com as instruções do fabricante. A cada 50 mL de ALI Diferenciação Média, adicione 100 μL de Primocina (50 mg/mL). Armazene protegido contra luz a 4 °C por até 1 mês. Classificar buffer Para cada 50 mL de Buffer de Tipo, combinar 47,5 mL da Solução de Sal Balanceado da Hanks, 1 mL de FBS, 200 μL de EDTA (500 mM), 1,25 mL de HePES Buffer (1 M), 50 μL de Y-27632 (10 mM) e 100 μL de Primocin (50 mg/mL). O filtro esterilizar usando um tamanho de poro de 0,4 μm. Armazene a 4 °C por até 1 mês. Meio de Criopreservação Para cada 50 mL de Médium criopreservador, combine 45 mL de Meio Celular Basal e 5 mL de sulfóxido de dimetil (DMSO). O filtro esterilizar usando um tamanho de poro de 0,4 μm. Armazene a 4 °C por até 1 mês. 2. Descongelamento de iBCs criopreservados Degelo (no gelo) um volume suficiente de fator de crescimento 3D reduziu a matriz extracelular (matriz 3D posterior). Mantenha no gelo até estar pronto para uso.NOTA: Ao descongelar um frasco (contendo 250.000 células), descongele 100-200 μL de matriz 3D. Descongele um frasco de suspensões de células únicas previamente criopreservadas de iBCs incubando em uma água de 37 °C ou banho de contas apenas até que não haja mídia congelada visível (1-2 min). Usando uma pipeta sorológica de 5 mL, adicione suspensão celular a um tubo cônico de 15 mL. Adicione 6-10 mL de DMEM/F12 dropwise à suspensão da célula, misture suavemente e centrífuga a 300 x g por 5 min para pelotar as células. Aspire o supernascer e resuspenja a pelota celular em 1 mL de Meio Celular Basal com uma micropipette P1000. Remova uma alíquota de 10 μL e realize uma contagem de células. Centrifugar as células a 300 x g por 5 min. Aspire o supernascer e resuspenque as células a uma densidade de 4.000 células/μL em matriz 3D previamente descongelada com uma micropipette P1000.NOTA: É fundamental evitar adicionar bolhas à matriz 3D. Pipeta a matriz devagar e com cuidado. Com uma micropipette P200, adicione uma gota (25 ou 50 μL) à base de cada poço de uma placa tratada de cultura de tecido de 12 poços. Se começar com 250.000 células congeladas, o número esperado de gotículas nesta etapa está entre 3-4 (gotículas de 25 μL), dependendo da viabilidade celular. Incubar a placa a 37 °C por aproximadamente 15 min e, em seguida, adicione o suficiente de Meio celular basal a cada poço para submergir totalmente a gota (1,5 mL para 50 μL; 1 mL para 25 μL), usando uma pipeta sorológica de 5 mL. Devolva a placa a uma incubadora umidificada. Células de alimentação a cada 2 dias usando o meio celular basal fresco. Adicione meio fresco ao lado do poço com pipeta sorológica de 5 mL, tomando cuidado para não perturbar a gota das células.NOTA: A densidade de células emplacaram nesta fase é 10 vezes maior do que a passagem de rotina de iBCs na seção 3. 3. Dissociação de esferoides e expansão de iBCs na cultura 3D Degelo (no gelo) um volume suficiente de matriz 3D. Mantenha no gelo até estar pronto para uso.NOTA: O volume da matriz 3D necessária varia de quantas células o usuário precisará. Aproximadamente 5-7 dias depois, aspire o meio de cada poço e com uma micropipette P1000, adicione 1 mL de Dispase II (1 U/mL) diretamente sobre os esferoides para dissociar da gotícula da matriz. Coloque a placa na incubadora de 37 °C por 10-15 min. Usando uma micropipette P1000, pipeta o Dispase para cima e para baixo 1-2 vezes, quebrando grandes aglomerados de matriz 3D. Retorne a placa a 37 °C por mais 30-40 min, permitindo que a matriz se dissolva completamente. Quando a gotícula da matriz 3D não estiver mais visível sob o microscópio de luz, adicione os esferoides livremente flutuantes a um cônico de 15 mL usando uma ponta de pipeta sorológica de 5 mL. Adicione DMEM/F12 para um volume final de 10 mL por cônica e centrífuga a 200 x g por 3 min para pelotar os esferoides. Aspire o supernasce e adicione 1 mL de trippsina de 0,05% (37 °C) para cada gotícula inicial dissociada (por exemplo, se começar com quatro gotículas, adicione 4 mL trypsin ao frasco cônico). Incubar a 37 °C, triturando com frequência (a cada 2-3 min). Avalie com o microscópio de luz a cada poucos minutos. Uma vez que a maioria (>90%) dos esferoides tenham sido dissociados a células únicas, adicione 10% de Soro Bovino Fetal (em DMEM/F12) a uma proporção de volume de 1:1 para a trippsina. Filtre as células através de um coador de células de 40 μm e centrífuga a 300 x g por 5 min. Realize uma contagem de células e resuspense as células a uma densidade de 400 células/μL de matriz 3D descongelada. Evite introduzir bolhas de ar. Resuspenda quantas gotículas necessários para a aplicação a jusante. Repita o passo 2.6-2.9 para cada poço. 4. Avaliação e purificação de iBCs NGFR+ Após 10-14 dias da passagem mais recente, dissociar os esferoides a uma única suspensão celular como nas etapas 3.2-3.5 e realizar uma contagem celular.NOTA: Diferentes linhas iPSC se comportam de forma diferente; portanto, a faixa de 10-14 dias pode variar para diferentes iBCs. Consulte a Figura 2 para aparições típicas de iBCs 3D após 1, 4, 8 e 14 dias, quando são adequados para a classificação celular NGFR+. A classificação mais cedo do que o recomendado (por exemplo, dia 8 como na Figura 2C), resulta em um número de células mais baixa com expressão de NGFR menos frequente. A classificação mais tarde do que o recomendado (por exemplo, maior que 14 dias após a passagem mais recente) leva à má sobrevivência celular pós-tipo. Resuspend as células a uma densidade de 1 x 106 células/100 μL em Sort Buffer (população principal). Transfira uma pequena alíquota (25-50 μL) para um tubo separado (população menor). Adicione anticorpo anti-NGFR conjugado (diluição de 1:100) à população celular principal. Adicione anticorpo de controle de isótipo (diluição 1:200) à população celular menor. Proteja as células da luz e mantenha no gelo por 30 minutos, intermitentemente (a cada 5-10 minutos) triturando as células para evitar a dotização. Após 30 min, adicione o Buffer de classificação em uma proporção de 1:1 para cada tubo de células. Células centrífugas a 300 x g por 5 min. Aspire o supernasciente, resuspenda as células pelotas no Buffer de classificação a uma densidade de 10 x 106 células/mL, e adicione mancha de célula viva ou morta. Usando a estratégia de gating NGFR+ apropriada (baseada no controle do isótipo, ver Figura 3), classifique células NGFR+ vivas suficientes para aplicações necessárias a jusante.NOTA: Se usar iBCs com repórteres fluorescentes (ou seja, NKX2-1GFP TP63tdTomato), recomenda-se classificar para células “triple positive” (ou seja, NKX2-1GFP+, TP63tdTomato+, NGFR+), com seleção e compensação de portão apropriadas (Figura 3). Durante essa expansão dos iBCs, uma proporção de células se diferencia em células secretas e uma proporção muito pequena de células multiciliadas também podem ser detectadas. Ambas as populações são NGFR-. 5. Geração de culturas mucociliary ALI Prepare as pastilhas de membrana porosa de 6,5 mm adicionando uma matriz de 200 μL à câmara apical (matriz qualificada por células-tronco embrionárias humanas ou laminina humana recombinante-521) de acordo com a instrução do fabricante. Coloque a 37 °C por pelo menos 2 h antes da necessidade. Aspire a matriz de revestimento da câmara apical da inserção. Adicione 500 μL do meio de célula basal à câmara basolateral. Resuspend pelo menos 30.000 células NGFR+ classificadas (a partir da etapa 4.5) em 100-200 μL Basal Cell Medium e transferência para a câmara apical usando uma micropipette P200. Repita para quantos poços desejarem (e células disponíveis). Coloque a placa na incubadora umidificada de 37 °C. Em 2-3 dias, aspirar câmaras apical e basolateral e alimentar-se com médio celular basal fresco (500 μL a apical, 100 μL para basolateral). Monitore a câmara apical diariamente com microscopia leve. Quando as células são >80% confluentes (tipicamente 3-7 dias), substitua o meio de célula basal por meio de diferenciação ALI (não pré-aquecido) em câmaras apical e basolateral. Ao trabalhar com o ALI Diferenciação Média, proteja-se contra a luz mantendo os recipientes de mídia envoltos em papel alumínio e desligando as luzes aéreas quando possível. No dia seguinte, aspire o meio da câmara apical, expondo assim a superfície apical ao ar. Substitua a mídia média de diferenciação ALI na câmara basolateral a cada 2-3 dias. Monitore a aparência cultural a cada 1-2 dias. Aspire cuidadosamente qualquer líquido acumulado da câmara apical, sem perturbar a camada celular. Avalie a resistência elétrica transeptelial (TEER) para integridade epitelial.NOTA: O TEER pode ser avaliado nos dias seguintes à exposição ao ar para dar uma leitura da integridade da camada epitelial. O momento ideal para medir o TEER não foi estabelecido, embora valores consistentes com diferenciação mucociliaria de alta qualidade sejam tipicamente >500 x cm2. Se for necessário remover detritos ou muco, adicione suavemente 100 μL PBS (sem Ca2+ ou Mg2+) à câmara apical. Incubar a 37 °C por 10 min e, em seguida, aspirar cuidadosamente PBS. Após 7-10 dias de exposição ao ar, cílios motile normalmente aparecem e podem ser vistos usando microscopia leve. Dependendo do experimento planejado e da leitura, as células podem ser analisadas após 14-28 dias de exposição ao ar.NOTA: Se as células fluorescentes do repórter tiverem sido usadas, e se um microscópio fluorescente de células vivas estiver disponível, as células podem ser rastreadas com microscopia leve, bem como fluorescência de repórteres. 6. Criopreservação opcional (mas recomendada) de iBCs Após 10-14 dias da mais recente passagem de cultura 3D, dissociar os esferoides à suspensão de célula única como nas etapas 3.2-3.5. Faça uma contagem de células. Resuspend em Criopreservação Média a uma densidade de 250.000 células /500 μL em um criovial. Coloque o cryovial(s) em um recipiente para garantir uma queda constante da temperatura (1 °C/min) e transfira para -80 °C por 24-48 h, seguido de transferência para -150 °C para armazenamento a longo prazo.NOTA: A criopreservação repetida, bem como a criopreservação de células classificadas anteriormente NGFR+foram realizadas, mas estas não foram adequadamente avaliadas para a viabilidade celular e a capacidade de formar culturas ali funcionais. Especialmente com a passagem celular estendida, recomenda-se avaliar para o karyótipo, pois isso tem sido observado para variar em iPSCs e células derivadas do iPSC.