Erzeugung von Atemwegs-Epithelzell-Luft-Flüssig-Grenzflächenkulturen aus humanen pluripotenten Stammzellen

Jeder der folgenden Schritte sollte mit steriler Technik in einer Laminar-Flow-Haube der Biosicherheitsstufe 2 durchgeführt werden. Alle Medien sollten vor der Zugabe zu Zellen auf Raumtemperatur (22 °C) erwärmt werden, sofern nicht ausdrücklich anders angegeben. Jeder Zentrifugationsschritt sollte bei Raumtemperatur (ca. 22 °C) durchgeführt werden. Abbildung 1 zeigt die Schaltpläne des Protokolls. 1. Vorbereitung der erforderlichen Medien HINWEIS: Weitere Informationen finden Sie in der Zusatzdatei 1. Basalzellmedium Bereiten Sie das Basismedium gemäß den Anweisungen des Herstellers vor. Zu jeweils 50 ml des Basismediums fügen Sie 5 μL A83-01 (10 mM), 5 μL DMH1 (10 mM), 50 μL Y-27632 (10 mM) und 100 μL Primocin (50 mg/ml) hinzu. Im Folgenden wird dieses Medium als Basalzellmedium bezeichnet. Bis zu 1 Monat bei 4 °C lagern. ALI-Differenzierungsmedium Bereiten Sie das Medium gemäß den Anweisungen des Herstellers vor. Zu jedem 50 ml ALI-Differenzierungsmedium 100 μL Primocin (50 mg/ml) hinzufügen. Bis zu 1 Monat lichtgeschützt bei 4 °C lagern. Sortierpuffer Kombinieren Sie pro 50 ml Sortierpuffer 47,5 ml ausgewogene Salzlösung von Hanks, 1 ml FBS, 200 μL EDTA (500 mM), 1,25 ml HEPES-Puffer (1 m), 50 μL Y-27632 (10 mM) und 100 μL Primocin (50 mg/ml). Filter sterilisieren mit einer Porengröße von 0,4 μm. Bis zu 1 Monat bei 4 °C lagern. Kryokonservierungsmedium Kombinieren Sie pro 50 ml Kryokonservierungsmedium 45 ml Basalzellmedium und 5 ml Dimethylsulfoxid (DMSO). Filter sterilisieren mit einer Porengröße von 0,4 μm. Bis zu 1 Monat bei 4 °C lagern. 2. Auftauen von kryokonservierten iBCs Tauen Sie (auf Eis) ein ausreichendes Volumen an 3-D-Wachstumsfaktor reduzierte extrazelluläre Matrix (im Folgenden 3-D-Matrix). Auf Eis halten, bis es einsatzbereit ist.HINWEIS: Wenn Sie eine Durchstechflasche (mit 250.000 Zellen) auftauen, tauen Sie 100-200 μL 3D-Matrix auf. Tauen Sie eine Durchstechflasche mit zuvor kryokonservierten Einzelzellsuspensionen von iBCs auf, indem Sie in einem 37 °C warmen Wasser- oder Perlenbad inkubieren, bis kein sichtbares gefrorenes Medium mehr vorhanden ist (1-2 min). Fügen Sie mit einer serologischen 5-ml-Pipette Zellsuspension zu einem 15-ml-Konustubus hinzu. 6-10 ml DMEM/F12 tropfenweise in die Zellsuspension geben, vorsichtig mischen und bei 300 x g für 5 min zentrifugieren, um die Zellen zu pelletieren. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml Basalzellmedium mit einer P1000-Mikropipette. Entfernen Sie ein 10 μL Aliquot und führen Sie eine Zellzählung durch. Zentrifen Sie die Zellen bei 300 x g für 5 min. Aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen mit einer Dichte von 4.000 Zellen/μL in zuvor aufgetauter 3D-Matrix mit einer P1000-Mikropipette.HINWEIS: Es ist wichtig, das Hinzufügen von Blasen zur 3D-Matrix zu vermeiden. Pipettieren Sie die Matrix langsam und vorsichtig. Bei einer P200-Mikropipette fügen Sie einen Tröpfchen (25 oder 50 μL) zur Basis jeder Vertiefung einer 12-Well-Gewebekultur-behandelten Platte hinzu. Wenn mit 250.000 gefrorenen Zellen begonnen wird, liegt die erwartete Anzahl der Tröpfchen in diesem Schritt zwischen 3-4 (25 μL Tröpfchen), abhängig von der Zelllebensfähigkeit. Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C für ungefähr 15 Minuten und fügen Sie dann genügend Basalzellmedium zu jeder Vertiefung hinzu, um das Tröpfchen vollständig einzutauchen (1,5 ml für 50 μL; 1 ml für 25 μL), wobei eine serologische 5 ml Pipette verwendet wird. Bringen Sie die Platte in einen befeuchteten Inkubator zurück. Füttern Sie die Zellen alle 2 Tage mit frischem Basalzellmedium. Fügen Sie frisches Medium an der Seite des Brunnens mit 5 ml serologischer Pipette hinzu und achten Sie darauf, das Tröpfchen der Zellen nicht zu stören.HINWEIS: Die Dichte der in diesem Stadium plattierten Zellen ist 10-mal höher als die routinemäßige Übertragung von iBCs in Abschnitt 3. 3. Dissoziation von Sphäroiden und Expansion von iBCs in 3D-Kultur Tauen Sie (auf Eis) ein ausreichendes Volumen an 3D-Matrix auf. Auf Eis halten, bis es einsatzbereit ist.HINWEIS: Das erforderliche Volumen der 3D-Matrix hängt davon ab, wie viele Zellen der Benutzer benötigt. Etwa 5-7 Tage später das Medium aus jeder Vertiefung abpumpen und mit einer P1000-Mikropipette 1 ml Dispase II (1 U/ml) direkt auf die Sphäroide geben, um vom Tröpfchen der Matrix zu dissoziieren. Legen Sie die Platte für 10-15 min in den 37 °C Inkubator. Mit einer P1000-Mikropipette pipettieren Sie die Dispase 1-2 Mal auf und ab und brechen große Klumpen der 3D-Matrix auf. Bringen Sie die Platte für weitere 30-40 min auf 37 °C zurück, damit sich die Matrix vollständig auflösen kann. Wenn der Tropfen der 3D-Matrix unter dem Lichtmikroskop nicht mehr sichtbar ist, fügen Sie die frei schwebenden Sphäroide mit einer serologischen 5-ml-Pipettenspitze zu einer 15-ml-Kegelspitze hinzu. DMEM/F12 für ein Endvolumen von 10 ml pro Kegel und Zentrifuge bei 200 x g für 3 min hinzufügen, um die Sphäroide zu pelletieren. Saugen Sie den Überstand an und fügen Sie 1 ml 0,05% Trypsin (37 °C) für jedes anfängliche dissoziierte Tröpfchen hinzu (z. B. wenn Sie mit vier Tröpfchen beginnen, fügen Sie 4 ml Trypsin in den konischen Kolben hinzu). Bei 37 °C inkubieren, häufig verkümmern (alle 2-3 min). Auswerten mit dem Lichtmikroskop alle paar Minuten. Sobald die Mehrheit (>90%) der Sphäroide zu einzelnen Zellen dissoziiert wurde, fügen Sie 10% fetales Rinderserum (in DMEM/F12) bei einem Volumenverhältnis von 1:1 zum Trypsin hinzu. Filtern Sie die Zellen durch ein 40 μm Zellsieb und eine Zentrifuge bei 300 x g für 5 min. Führen Sie eine Zellzählung durch und suspendieren Sie die Zellen gleichmäßig bei einer Dichte von 400 Zellen / μL aufgetauter 3D-Matrix. Vermeiden Sie die Einführung von Luftblasen. Suspendieren Sie so viele Tröpfchen wie für die nachgeschaltete Anwendung erforderlich. Wiederholen Sie die Schritte 2.6-2.9 für jedes Well. 4. Evaluierung und Reinigung von NGFR+ iBCs Nach 10-14 Tagen der letzten Passage dissoziieren Sie die Sphäroide zu einer einzelnen Zellsuspension wie in den Schritten 3.2-3.5 und führen eine Zellzählung durch.HINWEIS: Verschiedene iPSC-Linien verhalten sich unterschiedlich. Daher kann der Bereich von 10-14 Tagen für verschiedene iBCs variieren. In Abbildung 2 finden Sie typische Erscheinungsbilder von 3D-iBCs nach 1, 4, 8 und 14 Tagen, wenn sie für die NGFR+-Zellsortierung geeignet sind. Eine frühere Sortierung als empfohlen (z. B. Tag 8 wie in Abbildung 2C) führt zu einer insgesamt niedrigeren Zellzahl mit weniger häufiger NGFR-Expression. Eine spätere Sortierung als empfohlen (z. B. mehr als 14 Tage nach der letzten Passage) führt zu einem schlechten Überleben der Zellen nach der Sortierung. Resuspendieren Sie die Zellen bei einer Dichte von 1 x 106 Zellen/100 μL im Sortierpuffer (Hauptpopulation). Übertragen Sie ein kleines Aliquot (25-50 μL) auf ein separates Röhrchen (kleine Population). Fügen Sie der Hauptzellpopulation einen konjugierten Anti-NGFR-Antikörper (1:100-Verdünnung) hinzu. Fügen Sie der kleinen Zellpopulation einen Antikörper zur Isotypkontrolle (1:200-Verdünnung) hinzu. Schützen Sie die Zellen vor Licht und halten Sie sie 30 Minuten lang auf Eis, wobei Sie die Zellen intermittierend (alle 5-10 Minuten) verzerren, um eine Pelletierung zu verhindern. Fügen Sie nach 30 Minuten den Sortierpuffer im Verhältnis 1:1 zu jedem Zellröhrchen hinzu. Zentrifugenzellen bei 300 x g für 5 min. Aspirieren Sie den Überstand, suspendieren Sie die pelletierten Zellen im Sortierpuffer mit einer Dichte von 10 x 106 Zellen / ml und fügen Sie lebende oder tote Zellflecken hinzu. Sortieren Sie mit der geeigneten NGFR+-Gating-Strategie (basierend auf der Isotypsteuerung, siehe Abbildung 3) genügend lebende NGFR+-Zellen für die erforderlichen nachgelagerten Anwendungen.HINWEIS: Bei Verwendung von iBCs mit fluoreszierenden Reportern (z. B. NKX2-1 GFP TP63 tdTomato) wird empfohlen, nach “dreifach positiven” Zellen (d. h. NKX2-1GFP+, TP63tdTomato+,NGFR+) mit entsprechender Gate-Auswahl und Kompensation zu sortieren (Abbildung 3). Während dieser Expansion von iBCs differenziert sich ein Teil der Zellen in sekretorische Zellen und es kann auch ein sehr geringer Anteil an vermehrten Zellen nachgewiesen werden. Beide Populationen sind NGFR-. 5. Generierung mukoziliärer ALI-Kulturen Bereiten Sie 6,5 mm poröse Membraneinsätze vor, indem Sie der apikalen Kammer eine 200-μL-Matrix (humane embryonale Stammzell-qualifizierte Matrix oder rekombinantes humanes Laminin-521) gemäß den Anweisungen des Herstellers hinzufügen. Vor Bedarf mindestens 2 h bei 37 °C platzieren. Saugen Sie die Beschichtungsmatrix aus der apikalen Kammer des Einsatzes ab. 500 μL des Basalzellmediums in die basolaterale Kammer geben. Mindestens 30.000 sortierte NGFR+-Zellen (ab Schritt 4.5) in 100-200 μL Basalzellmedium resuspendieren und mit einer P200-Mikropipette in die apikale Kammer überführen. Wiederholen Sie dies für so viele Vertiefungen wie gewünscht (und Zellen verfügbar). Legen Sie die Platte in einen befeuchteten 37 °C Inkubator. In 2-3 Tagen aspirieren Sie apikale und basolaterale Kammern und füttern mit frischem Basalzellmedium (500 μL bis apikal, 100 μL bis basolateral). Überwachen Sie die apikale Kammer täglich mit Lichtmikroskopie. Wenn die Zellen zu >80% konfluent sind (typischerweise 3-7 Tage), ersetzen Sie das Basalzellmedium durch das ALI-Differenzierungsmedium (nicht vorgewärmt) sowohl in apikalen als auch in basolateralen Kammern. Wenn Sie mit ALI Differentiation Medium arbeiten, schützen Sie sich vor Licht, indem Sie Medienbehälter in Folie eingewickelt halten und die Deckenleuchten ausschalten, wenn möglich. Am nächsten Tag saugen Sie das Medium aus der apikalen Kammer ab und setzen so die apikale Oberfläche der Luft aus. Ersetzen Sie das ALI-Differenzierungsmedium alle 2-3 Tage in der basolateralen Kammer. Überwachen Sie das Kulturerscheinungsbild alle 1-2 Tage. Saugen Sie die angesammelte Flüssigkeit vorsichtig aus der apikalen Kammer ab, ohne die Zellschicht zu stören. Beurteilen Sie den transepithelialen elektrischen Widerstand (TEER) für die epitheliale Integrität.HINWEIS: TEER kann in den Tagen nach der Luftexposition beurteilt werden, um die Integrität der Epithelschicht abzulesen. Der ideale Zeitpunkt für die Messung von TEER wurde nicht festgelegt, obwohl Werte, die mit einer qualitativ hochwertigen mukoziliären Differenzierung übereinstimmen, typischerweise >500 xcm 2 betragen. Wenn es notwendig ist, Ablagerungen oder Schleim zu entfernen, fügen Sie vorsichtig 100 μL PBS (ohne Ca 2 +oder Mg 2 +) in die apikale Kammer hinzu. Bei 37 °C für 10 min inkubieren und dann PBS vorsichtig aspirieren. Nach 7-10 Tagen Luftexposition treten typischerweise bewegliche Zilien auf und können mit Lichtmikroskopie gesehen werden. Je nach geplantem Experiment und Auslesung können Zellen nach 14-28 Tagen Luftexposition analysiert werden.HINWEIS: Wenn fluoreszierende Reporterzellen verwendet wurden und wenn ein Lebendzell-Fluoreszenzmikroskop verfügbar ist, können Zellen sowohl mit Lichtmikroskopie als auch mit Reporterfluoreszenz verfolgt werden. 6. Optionale (aber empfohlene) Kryokonservierung von iBCs Nach 10-14 Tagen der letzten 3D-Kulturpassage dissoziieren Sie die Sphäroide wie in den Schritten 3.2-3.5 zur Einzelzellsuspension. Führen Sie eine Zellzählung durch. Resuspend in Kryokonservierungsmedium bei einer Dichte von 250.000 Zellen/500 μL in einem Kryovitum. Legen Sie Kryoviale in einen Behälter, um einen stetigen Temperaturabfall (1 ° C / min) zu gewährleisten, und übertragen Sie ihn für 24-48 h auf -80 ° C, gefolgt von einem Transfer auf -150 ° C für die Langzeitlagerung.HINWEIS: Wiederholte Kryokonservierung sowie Kryokonservierung von zuvor NGFR+ sortierten Zellen wurden durchgeführt, aber diese wurden nicht ausreichend auf Zelllebensfähigkeit und die Fähigkeit, funktionelle ALI-Kulturen zu bilden, untersucht. Insbesondere bei längerem Zellpassaging wird empfohlen, den Karyotyp zu untersuchen, da festgestellt wurde, dass dies bei iPS-Zellen und iPSC-abgeleiteten Zellen variiert.