Summary

Análisis de una sola molécula de motores de la familia Kinesin-3 superprocesiva purificada Sf9

Published: July 27, 2022
doi:

Summary

Este estudio detalla la purificación de KIF1A (1-393LZ), un miembro de la familia de la quinesina-3, utilizando el sistema de expresión de baculovirus Sf9. El análisis de deslizamiento in vitro de una sola molécula y multimotor de estos motores purificados mostró propiedades de motilidad robustas comparables a los motores de lisado de células de mamíferos. Por lo tanto, el sistema Sf9-baculovirus es susceptible de expresar y purificar la proteína motora de interés.

Abstract

Un entorno celular complejo plantea desafíos para el análisis de la motilidad de una sola molécula. Sin embargo, el avance en las técnicas de imagen ha mejorado los estudios de una sola molécula y ha ganado una inmensa popularidad en la detección y comprensión del comportamiento dinámico de las moléculas marcadas con fluorescencia. Aquí, describimos un método detallado para estudios in vitro de moléculas individuales de motores de la familia kinesina-3 utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF). La quinesina-3 es una gran familia que desempeña funciones críticas en las funciones celulares y fisiológicas que van desde el transporte de carga intracelular hasta la división celular y el desarrollo. Hemos demostrado previamente que los motores de quinesina-3 dimérica constitutivamente activos exhiben una motilidad rápida y superprocesiva con alta afinidad de microtúbulos a nivel de molécula única utilizando lisados celulares preparados expresando motor en células de mamíferos. Nuestro laboratorio estudia los motores de quinesina-3 y sus mecanismos reguladores utilizando enfoques celulares, bioquímicos y biofísicos, y tales estudios exigen proteínas purificadas a gran escala. La expresión y purificación de estos motores utilizando células de mamíferos sería costosa y llevaría mucho tiempo, mientras que la expresión en un sistema de expresión procariota daría como resultado proteínas significativamente agregadas e inactivas. Para superar las limitaciones planteadas por los sistemas de purificación bacteriana y el lisado de células de mamíferos, hemos establecido un robusto sistema de expresión de baculovirus Sf9 para expresar y purificar estos motores. Los motores de quinesina-3 están marcados C-terminalmente con proteínas fluorescentes de 3-tándem (3xmCitirine o 3xmCit) que proporcionan señales mejoradas y disminución del fotoblanqueo. El análisis de deslizamiento in vitro de moléculas individuales y múltiples motores de proteínas purificadas con Sf9 demuestra que los motores de quinesina-3 son rápidos y superprocesales similares a nuestros estudios previos utilizando lisados de células de mamíferos. Otras aplicaciones que utilizan estos ensayos incluyen el conocimiento detallado de las condiciones de oligómeros de los motores, socios de unión específicos en paralelo a estudios bioquímicos y su estado cinético.

Introduction

Un entorno celular inmensamente abarrotado plantea muchos desafíos en la clasificación de proteínas y moléculas destinadas. Esta intensa carga de trabajo de organización y distribución espaciotemporal de moléculas dentro del citoplasma se ve facilitada por motores moleculares y pistas citoesqueléticas. Los motores moleculares son las enzimas que hidrolizan las monedas de energía como el ATP y utilizan esa energía durante el movimiento y la generación de fuerza1. Según la similitud de la secuencia de aminoácidos, las quinesinas se agrupan en 14 familias y, a pesar de esta similitud, cada motor contribuye de manera única al funcionamiento de una célula. Los motores de la familia Kinesin-3 constituyen uno de los más grandes, comprendiendo cinco subfamilias (KIF1, KIF13, KIF14, KIF16 y KIF28)2, asociadas con diversas funciones celulares y fisiológicas, incluyendo transporte de vesículas, señalización, mitosis, migración nuclear y desarrollo 3,4,5. El deterioro en la función de transporte de quinesina-3 implica en muchos trastornos neurodegenerativos, defectos del desarrollo y enfermedades cancerosas 6,7,8,9.

Trabajos recientes han demostrado que los motores de quinesina-3 son monómeros pero sufren dimerización inducida por la carga y dan como resultado una motilidad rápida y superprocesiva en comparación con la quinesinaconvencional 10,11,12,13. Su caracterización bioquímica y biofísica necesita una gran cantidad de proteínas activas purificadas. Sin embargo, su producción en el sistema de expresión procariota resultó en motores inactivos o agregados, presumiblemente debido a la incompatibilidad de la maquinaria de síntesis, plegamiento y modificación de proteínas 14,15,16,17,18. Para eludir tales limitaciones y aumentar el rendimiento, aquí hemos establecido un sistema robusto de expresión de baculovirus Sf9 para expresar y purificar estos motores.

El sistema de expresión de baculovirus utiliza líneas celulares de insectos Sf9 como sistema huésped para la expresión de proteínas recombinantes eucariotas de alto rendimiento 19,20. El baculovirus posee un fuerte promotor de poliedrina que ayuda en la expresión génica heteróloga y en la producción de proteínas recombinantes solubles17. Debido a su costo-efectividad, seguro de manejar y alta cantidad de expresión de proteínas activas, se ha convertido en una poderosa herramienta21. Para expresar una proteína de interés, un paso clave es generar una bacmid recombinante. Dado que los kits de generación de bacmid disponibles comercialmente son caros y trabajaremos con más muestras, desarrollamos un protocolo interno para insertos grandes y pequeños de motores de kinesina-3 en bacmids. Se utilizaron motores de quinesina-3 purificados con SF9 para caracterizar in vitro las propiedades de deslizamiento de microtúbulos de una sola molécula y multimotor utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF). Los motores están marcados C-terminalmente con moléculas fluorescentes de 3 tándem (3xmCit) para proporcionar una señal mejorada y una disminución del fotoblanqueo. Debido a su mayor relación señal-ruido, menos fototoxicidad e imágenes selectivas de un área muy pequeña cerca del cubreobjetos, las imágenes TIRF se han utilizado ampliamente para visualizar la dinámica de proteínas a nivel de molécula única in vivo e in vitro.

Este estudio discute la purificación de motores de quinesina-3 mediante el empleo del sistema de expresión de baculovirus Sf9 y el análisis in vitro de imágenes de molécula única y deslizamiento multimotor de motores utilizando microscopía TIRF. En conjunto, este estudio muestra que las propiedades de motilidad de los motores purificados Sf9 son idénticas a las de los motores preparados a partir de lisados celulares de mamíferos. Por lo tanto, creemos que el sistema Sf9-baculovirus se puede adaptar para expresar y purificar cualquier proteína motora de interés.

Protocol

1. Cultivo, transfección y generación de virus Sf9 NOTA: Mantener las células Sf9 en 30 ml de medio Sf-900/SFM en matraz cónico estéril desechable de 100 ml sin antibióticos/antimicóticos a 28 °C. Mantenga el cultivo de suspensión en un agitador orbital a 90 rpm. No se requiere suministro deCO2 ni mantenimiento de la humedad. Las células generalmente se subcultivan cada cuatro días inoculando 0.5 x 10 6 células / ml para alcanzar una densidad d…

Representative Results

Para expresar y purificar proteínas motoras recombinantes activas y funcionales a gran escala utilizando la expresión de Sf9-baculovirus, el sistema necesita la generación de partículas virales que lleven de manera estable una secuencia codificante para infectar las células Sf9. Para lograr esto, las células Sf9 se transfectaron con bacmid recombinante que codifica KIF1A (1-393LZ) -3xmCit-FLAG. Después de 72 h, una población significativa de células mostró expresión de proteína verde fluorescente (mCitrine) c…

Discussion

El sistema de expresión de baculovirus Sf9 es uno de los métodos más versátiles y exitosos para la producción de proteínas de alto rendimiento 19,36,37. La capacidad de modificación postraduccional de las células Sf9 es altamente comparable al sistema de mamíferos15. Una desventaja considerable de usar este sistema es que es lento y sensible a la contaminación. Uno de los pasos más críticos es…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

V.S. y P.S. agradecen a la Prof. Kristen J. Verhey (Universidad de Michigan, Ann Arbor, MI, EUA) y al Prof. Roop Mallik (Indian Institute of Technology Bombay (IITB), Mumbai, India) por su apoyo incondicional durante todo el estudio. P.S. agradece a la Dra. Sivapriya Kirubakaran por su apoyo durante todo el proyecto. V.S. reconoce la financiación a través de DBT (Subvención No.: BT/PR15214/BRB/10/1449/2015 y BT/RLF/Reentry/45/2015) y DST-SERB (Subvención No.: ECR/2016/000913). P.K.N reconoce al ICMR por su financiación (Subvención No. 5/13/13/2019/NCD-III). P.S. reconoce la financiación del horario de verano (Subvención No.: SR/WOS-A/LS-73/2017). D.J.S reconoce la beca de IIT Gandhinagar.

Materials

Sf9 culture and transfection materials
anti-FLAG M2 affinity Biolegend 651502 For motility purification
Aprotinin Sigma A6279 For motility assay and purification
Cellfectin Invitrogen 10362100 For Sf9 transfection
DTT Sigma D5545 For motility assay mixture
FLAG peptide Sigma F3290 For motility purification
Glycerol Sigma G5516 For motility purification
HEPES Sigma H3375 Preparing lysing Sf9 cells
IGEPAL CA 630 Sigma I8896 Preparing lysing buffer for Sf9 cells
KCl Sigma P9541 For motility purification
Leupeptin Sigma L2884 For motility assay and purification
MgCl2 Sigma M2670 For preparing lysis buffer
NaCl Sigma S7653 For preparing lysis buffer
PMSF Sigma P7626 For motility purification
Sf9 cells Kind gift from Dr. Thomas Pucadyil (Indian Institute of Science Education and Research, Pune, India). For baculovirs expression and purification
Sf9 culture bottles Thermo Scientific 4115-0125 For suspension culture
Sf-900/SFM medium (1X) Thermo Scientific 10902-096 -500ml For culturing Sf9 cells
Sucrose Sigma S1888 Preparing lysing buffer for Sf9 cells
Unsupplemented Grace’s media Thermo Scientific 11595030 -500ml For Sf9 transfection
Mirotubule Polymerization and Single molecule assay materails
ATP Sigma A2647 For motility and gliding assay
BSA Sigma A2153 For blocking motility chamber
Catalase Sigma C9322 For motility and gliding assay
DMSO Sigma D5879 For dissolving Rhodamine
EGTA Sigma 3777 For preparing buffers
Glucose Sigma G7021 For motility and gliding assay
Glucose oxidase Sigma G2133 For motility and gliding assay
GTP Sigma G8877 For microtubule polymerization
KOH Sigma P1767 Preparing PIPES buffer pH 6.9
PIPES Sigma P6757 For motility and gliding assay
Microtubule gliding assay materials
26G  needle Dispovan For shearing microtubules
Casein Sigma C3400 For microtubule glidning assay
GFP nanobodies Gift from Dr. Sivaraj Sivaramakrishnan (University of Minnesota, USA) For attaching motors to the coverslip
Rhodamine Thermo Scientific 46406 For preparing labelling tubulin
Microscope and other instruments
0.5ml, 1.5 and 2-ml microcentrifuge tubes Eppendorf For Sf9 culture and purification
10ml  disposable sterile pipettes Eppendorf For Sf9 culture and purification
10ul, 200ul, 1ml micropipette tips Eppendorf For Sf9 culture and purification
15ml concal tubes Eppendorf For Sf9 culture and purification
35mm cell culture dish Cole Palmer 15179-39 For Sf9 culture
Balance Sartorious 0.01g-300g
Benchtop orbial shaking incubator REMI For Sf9 suspenculture at 28oC
Camera EMCCD Andor iXon Ultra 897 For TIRF imaging and acquesition
Double sided tape Scotch For making motility chamber
Glass coverslip Fisherfinest 12-548-5A size; 22X30
Glass slide Blue Star For making motility chamber
Heating block Neuation Dissolving paraffin wax
Inverted microscope Nikon Eclipse Ti- U To check protein expression
Lasers 488nm (100mW) For TIRF imaging
Liquid nitrogen For sample freezing and storage
Microcapillary loading tip Eppendorf EP022491920 For shearing microtubules
Microscope Nikon Eclipse Ti2-E with DIC set up For TIRF imaging
Mini spin Genetix, BiotechAsia Pvt.Ltd For quick spin
Objective 100X TIRF objective with 1.49NA oil immersion For TIRF imaging
Optima UltraCentrifuge XE Beckman Coulter For protein purification
Parafilm Eppendorf
pH-meter Corning Coring 430 To adjust pH
Pipette-boy VWR For Sf9 culture and purification
Sorvall Legend Micro 21 Thermo Scientific For protein purification
Sorvall ST8R centrifuge Thermo Scientific Protein purification
ThermoMixer Eppendorf For microtubule polymerization
Ultracentrifuge rotor Beckman coulter SW60Ti rotor
Ultracentrifuge tubes Beckman 5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm
Vortex mixer Neuation Sample mixing
Wax Sigma V001228 To seal motility chamber

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Soppina, P., Shewale, D. J., Naik, P. K., Soppina, V. Single-Molecule Analysis of Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motors. J. Vis. Exp. (185), e63837, doi:10.3791/63837 (2022).

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