Sf9精製超加工キネシン-3ファミリーモーターの1分子解析

非常に混雑した細胞環境は、運命のタンパク質や分子を選別する際に多くの課題をもたらします。細胞質内の分子の組織化と時空間分布のこの激しい作業負荷は、分子モーターと細胞骨格トラックによって促進されます。分子モーターは、ATPなどのエネルギー通貨を加水分解し、運動や力の生成中にそのエネルギーを利用する酵素^です1。アミノ酸配列の類似性に基づいて、キネシンは14のファミリーにグループ化され、この類似性にもかかわらず、各モーターは細胞の機能に一意に貢献します。キネシン3ファミリーモーターは、5つのサブファミリー(KIF1、KIF13、KIF14、KIF16、KIF28⁾²からなる最大のモーターの1つであり、小胞輸送、シグナル伝達、有糸分裂、核移動、発生など、多様な細胞および生理学的機能に関連しています3,4,5。キネシン-3輸送機能の障害は、多くの神経変性疾患、発達障害、および癌疾患に関与しています6,7,8,9。

最近の研究では、キネシン-3モーターはモノマーであるが、貨物誘起二量体化を受け、従来のキネシン^10,11,12,13と比較して高速で超加工的な運動性をもたらすことが実証されている。それらの生化学的および生物物理学的特性評価には、大量の精製された活性タンパク質が必要です。しかし、原核生物発現系におけるそれらの産生は、おそらく不適合なタンパク質合成、折り畳みおよび修飾機構のために、不活性または凝集したモーターをもたらした14,15,16,17,18。このような制限を回避し、収量を増やすために、ここでは、これらのモーターを発現および精製するための堅牢なSf9バキュロウイルス発現システムを確立しました。

バキュロウイルス発現システムは、ハイスループット真核生物組換えタンパク質発現のための宿主系としてSf9昆虫細胞株を使用する^19,20。バキュロウイルスは、異種遺伝子発現と可溶性組換えタンパク質の産生を補助する強力なポリヘドリンプロモーターを持っています¹⁷。その費用対効果、取り扱いが安全で、かつ大量の活性タンパク質発現のために、それは強力なツール²¹となっている。目的のタンパク質を発現させるための重要なステップは、組換えバクミドを生成することです。市販のバクミド生成キットは高価であり、より多くのサンプルを扱うため、キネシン-3モーターをバクミドに大小両方のインサートするための社内プロトコルを開発しました。Sf9精製されたキネシン-3モーターを使用して、全反射蛍光(TIRF)顕微鏡を使用してin vitroの単一分子およびマルチモーター微小管滑走特性を特徴付けました。モーターは、3タンデム蛍光分子(3xmCit)でC末端にタグ付けされており、シグナルを強化し、光退色を低減します。TIRFイメージングは、シグナル対ノイズ比の増加、光毒性の低減、カバーガラスに近い非常に小さな領域の選択的イメージングにより、in vivoおよびin vitroで単一分子レベルでタンパク質動態を視覚化するために広く使用されています。

本研究では、Sf9バキュロウイルス発現系を用いたキネシン3モーターの精製と、TIRF顕微鏡を用いたモーターの in vitro 単一分子イメージングおよびマルチモーター滑空解析について説明します。全体として、この研究は、Sf9精製モーターの運動特性が哺乳類細胞溶解物から調製されたモーターの運動特性と同一であることを示しています。したがって、Sf9-バキュロウイルスシステムは、目的のモータータンパク質を発現および精製するように適応できると考えています。