Análise de molécula única de motores da família Sf9 superprocessiva superprocessiva cinesina-3
Summary
Este estudo detalha a purificação do KIF1A(1-393LZ), membro da família das cinesinas-3, utilizando o sistema de expressão do Sf9-baculovírus. A análise in vitro de deslizamento de molécula única e multimotor desses motores purificados exibiu propriedades de motilidade robustas comparáveis aos motores do lisado de células de mamíferos. Assim, o sistema Sf9-baculovírus é passível de expressar e purificar a proteína motora de interesse.
Abstract
Um ambiente celular complexo apresenta desafios para a análise da motilidade de molécula única. No entanto, o avanço nas técnicas de imagem melhorou os estudos de molécula única e ganhou imensa popularidade na detecção e compreensão do comportamento dinâmico de moléculas marcadas com fluorescência. Aqui, descrevemos um método detalhado para estudos in vitro de molécula única de motores da família da cinesina-3 usando microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRF). Kinesin-3 é uma grande família que desempenha papéis críticos em funções celulares e fisiológicas que vão desde o transporte de carga intracelular para a divisão celular para o desenvolvimento. Mostramos anteriormente que os motores de cinesina dimérica-3 constitutivamente ativos exibem motilidade rápida e superprocessiva com alta afinidade de microtúbulos no nível de molécula única usando lisados celulares preparados por expressão motora em células de mamíferos. Nosso laboratório estuda os motores da cinesina-3 e seus mecanismos regulatórios usando abordagens celulares, bioquímicas e biofísicas, e tais estudos exigem proteínas purificadas em larga escala. A expressão e purificação desses motores usando células de mamíferos seria cara e demorada, enquanto a expressão em um sistema de expressão procariótica resultou em proteína significativamente agregada e inativa. Para superar as limitações impostas pelos sistemas de purificação bacteriana e pelo lisado de células de mamíferos, estabelecemos um sistema robusto de expressão do baculovírus Sf9 para expressar e purificar esses motores. Os motores de cinesina-3 são C-terminalmente marcados com proteínas fluorescentes de 3 tandem (3xmCitirine ou 3xmCit) que fornecem sinais aprimorados e fotobranqueamento diminuído. A análise in vitro de gliding de molécula única e multimotor de proteínas purificadas Sf9 demonstra que os motores de cinesina-3 são rápidos e superprocessivos semelhantes aos nossos estudos anteriores usando lisatos de células de mamíferos. Outras aplicações que usam esses ensaios incluem conhecimento detalhado das condições dos oligômeros dos motores, parceiros de ligação específicos em paralelo com estudos bioquímicos e seu estado cinético.
Introduction
Um ambiente celular imensamente lotado apresenta muitos desafios na classificação de proteínas e moléculas destinadas. Essa intensa carga de trabalho de organização e distribuição espaço-temporal de moléculas dentro do citoplasma é facilitada por motores moleculares e trilhas citoesqueléticas. Os motores moleculares são as enzimas que hidrolisam as moedas de energia, como o ATP, e utilizam essa energia durante a geração de movimento e força1. Com base na semelhança da sequência de aminoácidos, as cinesinas são agrupadas em 14 famílias e, apesar dessa semelhança, cada motor contribui exclusivamente para o funcionamento de uma célula. Os motores da família Kinesin-3 constituem um dos maiores, compreendendo cinco subfamílias (KIF1, KIF13, KIF14, KIF16 e KIF28)2, associadas a diversas funções celulares e fisiológicas, incluindo transporte de vesículas, sinalização, mitose, migração nuclear e desenvolvimento 3,4,5. O comprometimento da função de transporte da cinesina-3 implica em muitos distúrbios neurodegenerativos, defeitos de desenvolvimento e doenças oncológicas 6,7,8,9.
Trabalhos recentes demonstraram que os motores de cinesina-3 são monômeros, mas sofrem dimerização induzida por carga e resultam em motilidade rápida e superprocessiva em comparação com a cinesina convencional10,11,12,13. Sua caracterização bioquímica e biofísica precisa de uma grande quantidade de proteínas purificadas e ativas. No entanto, sua produção no sistema de expressão procariótica resultou em motores inativos ou agregados, presumivelmente devido a máquinas incompatíveis de síntese, dobramento e modificação de proteínas 14,15,16,17,18. Para contornar tais limitações e aumentar o rendimento, aqui estabelecemos um sistema robusto de expressão do baculovírus Sf9 para expressar e purificar esses motores.
O sistema de expressão de baculovírus utiliza linhagens celulares de insetos Sf9 como sistema hospedeiro para expressão de proteínas recombinantes eucarióticas de alto rendimento19,20. O baculovírus possui um forte promotor de poliedrina que auxilia na expressão gênica heteróloga e na produção de proteínas recombinantes solúveis17. Devido à sua relação custo-benefício, segurança de manusear e alta quantidade de expressão de proteína ativa, tornou-se uma ferramenta poderosa21. Para expressar uma proteína de interesse, um passo fundamental é gerar um bacmida recombinante. Como os kits de geração de bacmid disponíveis comercialmente são caros e trabalharemos com mais amostras, desenvolvemos um protocolo interno para inserções grandes e pequenas de motores de cinesina-3 em bacmids. Motores de cinesina-3 purificados com Sf9 foram utilizados para caracterizar as propriedades de deslizamento de microtúbulos monomolécula e multimotor in vitro usando microscopia de fluorescência de reflexão interna total (TIRF). Os motores são marcados terminalmente em C com moléculas fluorescentes de 3 tandem (3xmCit) para fornecer sinal aprimorado e fotobranqueamento diminuído. Devido ao aumento da relação sinal-ruído, menor fototoxicidade e imagem seletiva de uma área muito pequena perto da lâmina de cobertura, a imagem TIRF tem sido amplamente utilizada para visualizar a dinâmica de proteínas no nível de molécula única in vivo e in vitro.
Este estudo discute a purificação de motores de cinesina-3 empregando o sistema de expressão do baculovírus Sf9 e imagens in vitro de molécula única e análise de deslizamento multimotor de motores utilizando microscopia TIRF. No total, este estudo mostra que as propriedades de motilidade dos motores purificados Sf9 são idênticas às dos motores preparados a partir de lisatos de células de mamíferos. Assim, acreditamos que o sistema Sf9-baculovírus pode ser adaptado para expressar e purificar qualquer proteína motora de interesse.
Protocol
Representative Results
Discussion
O sistema de expressão do baculovírus Sf9 é um dos métodos mais versáteis e bem-sucedidos para a produção de proteínas de alto rendimento 19,36,37. A capacidade de modificação pós-translacional das células Sf9 é altamente comparável ao sistema de mamíferos15. Uma desvantagem considerável do uso deste sistema é que ele é lento e sensível à contaminação. Uma das etapas mais críticas ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
V.S. e P.S. agradecem à Prof. Kristen J. Verhey (Universidade de Michigan, Ann Arbor, MI, EUA) e ao Prof. Roop Mallik (Indian Institute of Technology Bombay (IITB), Mumbai, Índia) por seu apoio incondicional durante todo o estudo. P.S. agradece à Dra. Sivapriya Kirubakaran por seu apoio durante todo o projeto. V.S. reconhece o financiamento através do DBT (Subvenção n.º: BT/PR15214/BRB/10/1449/2015 e BT/RLF/Reentrada/45/2015) e do DST-SERB (Subvenção n.º: ECR/2016/000913). P.K.N reconhece o ICMR para financiamento (Subvenção nº 5/13/13/2019/NCD-III). P.S. reconhece o financiamento do horário de verão (Grant No.: SR/WOS-A/LS-73/2017). D.J.S reconhece a irmandade do IIT Gandhinagar.
Materials
| Sf9 culture and transfection materials | |||
| anti-FLAG M2 affinity | Biolegend | 651502 | For motility purification |
| Aprotinin | Sigma | A6279 | For motility assay and purification |
| Cellfectin | Invitrogen | 10362100 | For Sf9 transfection |
| DTT | Sigma | D5545 | For motility assay mixture |
| FLAG peptide | Sigma | F3290 | For motility purification |
| Glycerol | Sigma | G5516 | For motility purification |
| HEPES | Sigma | H3375 | Preparing lysing Sf9 cells |
| IGEPAL CA 630 | Sigma | I8896 | Preparing lysing buffer for Sf9 cells |
| KCl | Sigma | P9541 | For motility purification |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | For motility assay and purification |
| MgCl2 | Sigma | M2670 | For preparing lysis buffer |
| NaCl | Sigma | S7653 | For preparing lysis buffer |
| PMSF | Sigma | P7626 | For motility purification |
| Sf9 cells | Kind gift from Dr. Thomas Pucadyil (Indian Institute of Science Education and Research, Pune, India). | For baculovirs expression and purification | |
| Sf9 culture bottles | Thermo Scientific | 4115-0125 | For suspension culture |
| Sf-900/SFM medium (1X) | Thermo Scientific | 10902-096 -500ml | For culturing Sf9 cells |
| Sucrose | Sigma | S1888 | Preparing lysing buffer for Sf9 cells |
| Unsupplemented Grace’s media | Thermo Scientific | 11595030 -500ml | For Sf9 transfection |
| Mirotubule Polymerization and Single molecule assay materails | |||
| ATP | Sigma | A2647 | For motility and gliding assay |
| BSA | Sigma | A2153 | For blocking motility chamber |
| Catalase | Sigma | C9322 | For motility and gliding assay |
| DMSO | Sigma | D5879 | For dissolving Rhodamine |
| EGTA | Sigma | 3777 | For preparing buffers |
| Glucose | Sigma | G7021 | For motility and gliding assay |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133 | For motility and gliding assay |
| GTP | Sigma | G8877 | For microtubule polymerization |
| KOH | Sigma | P1767 | Preparing PIPES buffer pH 6.9 |
| PIPES | Sigma | P6757 | For motility and gliding assay |
| Microtubule gliding assay materials | |||
| 26G needle | Dispovan | For shearing microtubules | |
| Casein | Sigma | C3400 | For microtubule glidning assay |
| GFP nanobodies | Gift from Dr. Sivaraj Sivaramakrishnan (University of Minnesota, USA) | For attaching motors to the coverslip | |
| Rhodamine | Thermo Scientific | 46406 | For preparing labelling tubulin |
| Microscope and other instruments | |||
| 0.5ml, 1.5 and 2-ml microcentrifuge tubes | Eppendorf | For Sf9 culture and purification | |
| 10ml disposable sterile pipettes | Eppendorf | For Sf9 culture and purification | |
| 10ul, 200ul, 1ml micropipette tips | Eppendorf | For Sf9 culture and purification | |
| 15ml concal tubes | Eppendorf | For Sf9 culture and purification | |
| 35mm cell culture dish | Cole Palmer | 15179-39 | For Sf9 culture |
| Balance | Sartorious | 0.01g-300g | |
| Benchtop orbial shaking incubator | REMI | For Sf9 suspenculture at 28oC | |
| Camera | EMCCD Andor iXon Ultra 897 | For TIRF imaging and acquesition | |
| Double sided tape | Scotch | For making motility chamber | |
| Glass coverslip | Fisherfinest | 12-548-5A | size; 22X30 |
| Glass slide | Blue Star | For making motility chamber | |
| Heating block | Neuation | Dissolving paraffin wax | |
| Inverted microscope | Nikon Eclipse Ti- U | To check protein expression | |
| Lasers | 488nm (100mW) | For TIRF imaging | |
| Liquid nitrogen | For sample freezing and storage | ||
| Microcapillary loading tip | Eppendorf | EP022491920 | For shearing microtubules |
| Microscope | Nikon Eclipse Ti2-E with DIC set up | For TIRF imaging | |
| Mini spin | Genetix, BiotechAsia Pvt.Ltd | For quick spin | |
| Objective | 100X TIRF objective with 1.49NA oil immersion | For TIRF imaging | |
| Optima UltraCentrifuge XE | Beckman Coulter | For protein purification | |
| Parafilm | Eppendorf | ||
| pH-meter | Corning | Coring 430 | To adjust pH |
| Pipette-boy | VWR | For Sf9 culture and purification | |
| Sorvall Legend Micro 21 | Thermo Scientific | For protein purification | |
| Sorvall ST8R centrifuge | Thermo Scientific | Protein purification | |
| ThermoMixer | Eppendorf | For microtubule polymerization | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman coulter | SW60Ti rotor | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman | 5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm | |
| Vortex mixer | Neuation | Sample mixing | |
| Wax | Sigma | V001228 | To seal motility chamber |
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