Single-Molecule Analyse van Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motoren
Summary
Deze studie beschrijft de zuivering van KIF1A (1-393LZ), een lid van de kinesine-3-familie, met behulp van het Sf9-baculovirusexpressiesysteem. In vitro single-molecule en multi-motor zweefanalyse van deze gezuiverde motoren vertoonde robuuste motiliteitseigenschappen vergelijkbaar met motoren van zoogdiercellysaat. Sf9-baculovirussysteem is dus vatbaar voor expressie en zuivering van motoreiwit van belang.
Abstract
Een complexe cellulaire omgeving vormt een uitdaging voor de analyse van de beweeglijkheid van één molecuul. De vooruitgang in beeldvormingstechnieken heeft echter studies met één molecuul verbeterd en is enorm populair geworden bij het detecteren en begrijpen van het dynamische gedrag van fluorescerende moleculen. Hier beschrijven we een gedetailleerde methode voor in vitro single-molecule studies van kinesine-3 familie motoren met behulp van Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopie. Kinesine-3 is een grote familie die een cruciale rol speelt in cellulaire en fysiologische functies, variërend van intracellulair vrachttransport tot celdeling tot ontwikkeling. We hebben eerder aangetoond dat constitutief actieve dimerische kinesine-3-motoren een snelle en superprocessieve motiliteit vertonen met een hoge microtubule-affiniteit op het niveau van één molecuul met behulp van cellysaten die worden bereid door motor in zoogdiercellen tot expressie te brengen. Ons laboratorium bestudeert kinesine-3-motoren en hun regulerende mechanismen met behulp van cellulaire, biochemische en biofysische benaderingen, en dergelijke studies vereisen gezuiverde eiwitten op grote schaal. Expressie en zuivering van deze motoren met behulp van zoogdiercellen zou duur en tijdrovend zijn, terwijl expressie in een prokaryote expressiesysteem resulteerde in significant geaggregeerd en inactief eiwit. Om de beperkingen van bacteriële zuiveringssystemen en zoogdiercellysaat te overwinnen, hebben we een robuust Sf9-baculovirusexpressiesysteem opgezet om deze motoren tot expressie te brengen en te zuiveren. De kinesine-3 motoren zijn C-terminal gelabeld met 3-tandem fluorescerende eiwitten (3xmCitirine of 3xmCit) die zorgen voor verbeterde signalen en verminderde fotobleaching. In vitro single-molecule en multi-motor gliding analyse van Sf9 gezuiverde eiwitten tonen aan dat kinesine-3 motoren snel en superprocessief zijn, vergelijkbaar met onze eerdere studies met behulp van zoogdiercellysaten. Andere toepassingen die deze assays gebruiken, omvatten gedetailleerde kennis van oligomeercondities van motoren, specifieke bindingspartners die parallel lopen met biochemische studies en hun kinetische toestand.
Introduction
Een immens drukke celomgeving brengt veel uitdagingen met zich mee bij het sorteren van voorbestemde eiwitten en moleculen. Deze intense werklast van organisatie en spatiotemporale verdeling van moleculen in het cytoplasma wordt vergemakkelijkt door moleculaire motoren en cytoskeletale sporen. Moleculaire motoren zijn de enzymen die de energievaluta’s zoals ATP hydrolyseren en die energie gebruiken tijdens beweging en krachtgeneratie1. Op basis van de aminozuursequentieovereenkomst worden kinesines gegroepeerd in 14 families en ondanks deze gelijkenis draagt elke motor uniek bij aan het functioneren van een cel. Kinesine-3-familiemotoren vormen een van de grootste, bestaande uit vijf subfamilies (KIF1, KIF13, KIF14, KIF16 en KIF28)2, geassocieerd met diverse cellulaire en fysiologische functies, waaronder blaasjestransport, signalering, mitose, nucleaire migratie en ontwikkeling 3,4,5. Stoornissen in kinesine-3 transportfunctie impliceren in veel neurodegeneratieve aandoeningen, ontwikkelingsstoornissen en kankerziekten 6,7,8,9.
Recent werk heeft aangetoond dat kinesine-3-motoren monomeren zijn, maar door lading geïnduceerde dimerisatie ondergaan en resulteren in een snelle en superprocessieve beweeglijkheid in vergelijking met conventionele kinesine 10,11,12,13. Hun biochemische en biofysische karakterisering heeft een grote hoeveelheid gezuiverde, actieve eiwitten nodig. Hun productie in het prokaryote expressiesysteem resulteerde echter in inactieve of geaggregeerde motoren, vermoedelijk als gevolg van incompatibele eiwitsynthese-, vouw- en modificatiemachines 14,15,16,17,18. Om dergelijke beperkingen te omzeilen en de opbrengst te verhogen, hebben we hier een robuust Sf9-baculovirusexpressiesysteem opgezet om deze motoren tot expressie te brengen en te zuiveren.
Het baculovirusexpressiesysteem gebruikt Sf9-insectencellijnen als gastheersysteem voor high-throughput eukaryote recombinante eiwitexpressie19,20. Baculovirus bezit een sterke polyhedrinepromotor die helpt bij heterologe genexpressie en de productie van oplosbare recombinante eiwitten17. Vanwege de kosteneffectiviteit, veilig te hanteren en de hoge hoeveelheid actieve eiwitexpressie, is het een krachtig hulpmiddel geworden21. Om een eiwit van belang uit te drukken, is een belangrijke stap het genereren van een recombinant bacmide. Omdat de commercieel verkrijgbare bacmidegeneratoren duur zijn en we met meer monsters zullen werken, hebben we een intern protocol ontwikkeld voor zowel grote als kleine inserts van kinesine-3-motoren in bacmiden. Sf9-gezuiverde kinesine-3-motoren werden gebruikt om in vitro single-molecule en multi-motor microtubule gliding eigenschappen te karakteriseren met behulp van total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopie. Motoren zijn C-terminaal gelabeld met 3-tandem fluorescerende moleculen (3xmCit) om verbeterd signaal en verminderde fotobleaching te bieden. Vanwege de verhoogde signaal-ruisverhouding, minder fototoxiciteit en selectieve beeldvorming van een zeer klein gebied dicht bij de coverslip, is TIRF-beeldvorming op grote schaal gebruikt om eiwitdynamica op het niveau van één molecuul in vivo en in vitro te visualiseren.
Deze studie bespreekt de zuivering van kinesine-3-motoren door gebruik te maken van sf9-baculovirusexpressiesysteem en in vitro single-molecule imaging en multi-motor zweefanalyse van motoren met behulp van TIRF-microscopie. Al met al toont deze studie aan dat de beweeglijkheidseigenschappen van Sf9-gezuiverde motoren identiek zijn aan die van motoren bereid uit zoogdiercellysaten. Daarom geloven we dat het Sf9-baculovirussysteem kan worden aangepast om elk motoreiwit van belang tot expressie te brengen en te zuiveren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het Sf9-baculovirus expressiesysteem is een van de meest veelzijdige en succesvolle methoden voor high-throughput eiwitproductie 19,36,37. Het posttranslationele modificatievermogen van Sf9-cellen is sterk vergelijkbaar met het zoogdiersysteem15. Een aanzienlijk nadeel van het gebruik van dit systeem is dat het traag en gevoelig is voor verontreiniging. Een van de meest kritieke stappen is efficiënte inf…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
V.S. en P.S. bedanken Prof. Kristen J. Verhey (University of Michigan, Ann Arbor, MI, USA) en Prof. Roop Mallik (Indian Institute of Technology Bombay (IITB), Mumbai, India) voor hun onvoorwaardelijke steun gedurende het onderzoek. P.S. bedankt Dr. Sivapriya Kirubakaran voor haar steun gedurende het hele project. V.S. erkent financiering via DBT (Grant No.: BT/PR15214/BRB/10/1449/2015 en BT/RLF/Re-entry/45/2015) en DST-SERB (Grant No.: ECR/2016/000913). P.K.N erkent ICMR voor financiering (Subsidie nr. 5/13/13/2019/NCD-III). P.S. erkent financiering uit DST (Grant No.: SR/WOS-A/LS-73/2017). D.J.S erkent fellowship van IIT Gandhinagar.
Materials
| Sf9 culture and transfection materials | |||
| anti-FLAG M2 affinity | Biolegend | 651502 | For motility purification |
| Aprotinin | Sigma | A6279 | For motility assay and purification |
| Cellfectin | Invitrogen | 10362100 | For Sf9 transfection |
| DTT | Sigma | D5545 | For motility assay mixture |
| FLAG peptide | Sigma | F3290 | For motility purification |
| Glycerol | Sigma | G5516 | For motility purification |
| HEPES | Sigma | H3375 | Preparing lysing Sf9 cells |
| IGEPAL CA 630 | Sigma | I8896 | Preparing lysing buffer for Sf9 cells |
| KCl | Sigma | P9541 | For motility purification |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | For motility assay and purification |
| MgCl2 | Sigma | M2670 | For preparing lysis buffer |
| NaCl | Sigma | S7653 | For preparing lysis buffer |
| PMSF | Sigma | P7626 | For motility purification |
| Sf9 cells | Kind gift from Dr. Thomas Pucadyil (Indian Institute of Science Education and Research, Pune, India). | For baculovirs expression and purification | |
| Sf9 culture bottles | Thermo Scientific | 4115-0125 | For suspension culture |
| Sf-900/SFM medium (1X) | Thermo Scientific | 10902-096 -500ml | For culturing Sf9 cells |
| Sucrose | Sigma | S1888 | Preparing lysing buffer for Sf9 cells |
| Unsupplemented Grace’s media | Thermo Scientific | 11595030 -500ml | For Sf9 transfection |
| Mirotubule Polymerization and Single molecule assay materails | |||
| ATP | Sigma | A2647 | For motility and gliding assay |
| BSA | Sigma | A2153 | For blocking motility chamber |
| Catalase | Sigma | C9322 | For motility and gliding assay |
| DMSO | Sigma | D5879 | For dissolving Rhodamine |
| EGTA | Sigma | 3777 | For preparing buffers |
| Glucose | Sigma | G7021 | For motility and gliding assay |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133 | For motility and gliding assay |
| GTP | Sigma | G8877 | For microtubule polymerization |
| KOH | Sigma | P1767 | Preparing PIPES buffer pH 6.9 |
| PIPES | Sigma | P6757 | For motility and gliding assay |
| Microtubule gliding assay materials | |||
| 26G needle | Dispovan | For shearing microtubules | |
| Casein | Sigma | C3400 | For microtubule glidning assay |
| GFP nanobodies | Gift from Dr. Sivaraj Sivaramakrishnan (University of Minnesota, USA) | For attaching motors to the coverslip | |
| Rhodamine | Thermo Scientific | 46406 | For preparing labelling tubulin |
| Microscope and other instruments | |||
| 0.5ml, 1.5 and 2-ml microcentrifuge tubes | Eppendorf | For Sf9 culture and purification | |
| 10ml disposable sterile pipettes | Eppendorf | For Sf9 culture and purification | |
| 10ul, 200ul, 1ml micropipette tips | Eppendorf | For Sf9 culture and purification | |
| 15ml concal tubes | Eppendorf | For Sf9 culture and purification | |
| 35mm cell culture dish | Cole Palmer | 15179-39 | For Sf9 culture |
| Balance | Sartorious | 0.01g-300g | |
| Benchtop orbial shaking incubator | REMI | For Sf9 suspenculture at 28oC | |
| Camera | EMCCD Andor iXon Ultra 897 | For TIRF imaging and acquesition | |
| Double sided tape | Scotch | For making motility chamber | |
| Glass coverslip | Fisherfinest | 12-548-5A | size; 22X30 |
| Glass slide | Blue Star | For making motility chamber | |
| Heating block | Neuation | Dissolving paraffin wax | |
| Inverted microscope | Nikon Eclipse Ti- U | To check protein expression | |
| Lasers | 488nm (100mW) | For TIRF imaging | |
| Liquid nitrogen | For sample freezing and storage | ||
| Microcapillary loading tip | Eppendorf | EP022491920 | For shearing microtubules |
| Microscope | Nikon Eclipse Ti2-E with DIC set up | For TIRF imaging | |
| Mini spin | Genetix, BiotechAsia Pvt.Ltd | For quick spin | |
| Objective | 100X TIRF objective with 1.49NA oil immersion | For TIRF imaging | |
| Optima UltraCentrifuge XE | Beckman Coulter | For protein purification | |
| Parafilm | Eppendorf | ||
| pH-meter | Corning | Coring 430 | To adjust pH |
| Pipette-boy | VWR | For Sf9 culture and purification | |
| Sorvall Legend Micro 21 | Thermo Scientific | For protein purification | |
| Sorvall ST8R centrifuge | Thermo Scientific | Protein purification | |
| ThermoMixer | Eppendorf | For microtubule polymerization | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman coulter | SW60Ti rotor | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman | 5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm | |
| Vortex mixer | Neuation | Sample mixing | |
| Wax | Sigma | V001228 | To seal motility chamber |
References
- Vale, R. D. The molecular motor toolbox for intracellular transport. Cell. 112, 467-480 (2003).
- Miki, H., Okada, Y., Hirokawa, N. Analysis of the kinesin superfamily: insights into structure and function. Trends in Cell Biology. 15 (9), 467-476 (2005).
- Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).
- Hirokawa, N., Takemura, R. Molecular motors and mechanisms of directional transport in neurons. Nature Reviews Neuroscience. 6 (3), 201-214 (2005).
- Patel, N. M., et al. KIF13A motors are regulated by Rab22A to function as weak dimers inside the cell. Scientific Advances. 7 (6), (2021).
- Franker, M. A., Hoogenraad, C. C. Microtubule-based transport – basic mechanisms, traffic rules and role in neurological pathogenesis. Journal of Cellular Science. 126, 2319-2329 (2013).
- Gunawardena, S., Anderson, E. N., White, J. Axonal transport and neurodegenerative disease: vesicle-motor complex formation and their regulation. Degernative Neurological and Neuromuscular Disease. 4, 29-47 (2014).
- Rath, O., Kozielski, F. Kinesins and cancer. Nature Reviews Cancer. 12 (8), 527-539 (2012).
- Wang, Z. Z., et al. KIF14 promotes cell proliferation via activation of Akt and is directly targeted by miR-200c in colorectal cancer. International Journal of Oncology. 53 (5), 1939-1952 (2018).
- Guo, S. K., Shi, X. X., Wang, P. Y., Xie, P. Run length distribution of dimerized kinesin-3 molecular motors: comparison with dimeric kinesin-1. Scientific Reports. 9 (1), 16973 (2019).
- Scarabelli, G., et al. Mapping the processivity determinants of the Kinesin-3 motor domain. Biophysical Journal. 109 (8), 1537-1540 (2015).
- Soppina, V., et al. Dimerization of mammalian kinesin-3 motors results in superprocessive motion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 5562-5567 (2014).
- Soppina, V., Verhey, K. J. The family-specific K-loop influences the microtubule on-rate but not the superprocessivity of kinesin-3 motors. Molecular Biology Cell. 25 (14), 2161-2170 (2014).
- Soppina, V., et al. Kinesin-3 motors are fine-tuned at the molecular level to endow distinct mechanical outputs. BMC Biology. , (2022).
- Korten, T., Chaudhuri, S., Tavkin, E., Braun, M., Diez, S. Kinesin-1 Expressed in insect cells improves microtubule in vitro gliding performance, long-term stability and guiding efficiency in nanostructures. IEEE Transactions on Nanobioscience. 15 (1), 62-69 (2016).
- Schmidt, F. R. Recombinant expression systems in the pharmaceutical industry. Applied Microbiology and Biotechnology. 65 (4), 363-372 (2004).
- Kurland, C., Gallant, J. Errors of heterologous protein expression. Current Opinions in Biotechnology. 7 (5), 489-493 (1996).
- Tao, L., Scholey, J. M. Purification and assay of mitotic motors. Methods. 51 (2), 233-241 (2010).
- Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature Biotechnology. 23 (5), 567-575 (2005).
- Felberbaum, R. S. The baculovirus expression vector system: A commercial manufacturing platform for viral vaccines and gene therapy vectors. Biotechnology Journal. 10 (5), 702-714 (2015).
- Kumar, N., Pandey, D., Halder, A., Kumar, D., Gong, C. . Trends in Insect Molecular Biology and Biotechnology. , 163-191 (2018).
- Nagano, T. Development of fluorescent probes for bioimaging applications. Proceedings of the Japan Academy. Series B. Physical and Biological Sciences. 86 (8), 837-847 (2010).
- Hassan, M., Klaunberg, B. A. Biomedical applications of fluorescence imaging in vivo. Comparative Medicine. 54 (6), 635-644 (2004).
- Yang, Z., Samanta, S., Yan, W., Yu, B., Qu, J. Super-resolution microscopy for biological imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 3233, 23-43 (2021).
- Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
- Waters, J. C. Live-cell fluorescence imaging. Methods in Cell Biology. 114, 125-150 (2013).
- Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).
- Wojtovich, A. P., Foster, T. H. Optogenetic control of ROS production. Redox Biology. 2, 368-376 (2014).
- Cai, D., Verhey, K. J., Meyhofer, E. Tracking single Kinesin molecules in the cytoplasm of mammalian cells. Biophysical Journal. 92 (12), 4137-4144 (2007).
- Bohm, K. J., Stracke, R., Baum, M., Zieren, M., Unger, E. Effect of temperature on kinesin-driven microtubule gliding and kinesin ATPase activity. FEBS Letters. 466, 59-62 (2000).
- Porter, M. E., et al. Characterization of the microtubule movement produced by sea urchin egg kinesin. The Journal of Biological Chemistry. 262 (6), 2794-2802 (1987).
- Muyldermans, S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).
- Verma, S., Kumar, N., Verma, V. Role of paclitaxel on critical nucleation concentration of tubulin and its effects thereof. Biochemical and Biophysical Research Communications. 478 (3), 1350-1354 (2016).
- Parness, J., Horwitz, S. B. Taxol binds to polymerized tubulin in vitro. Journal of Cell Biology. 91 (2), 479-487 (1981).
- Schiff, P. B., Fant, J., Horwitz, S. B. Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol. Nature. 277 (5698), 665-667 (1979).
- Kato, T., Kageshima, A., Suzuki, F., Park, E. Y. Expression and purification of human (pro)renin receptor in insect cells using baculovirus expression system. Protein Expression and Purification. 58 (2), 242-248 (2008).
- Liu, F., Wu, X., Li, L., Liu, Z., Wang, Z. Use of baculovirus expression system for generation of virus-like particles: successes and challenges. Protein Expression and Purification. 90 (2), 104-116 (2013).
- Terpe, K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Applied Microbiology and Biotechnology. 60 (5), 523-533 (2003).
- Huang, S. T., et al. Liposomal paclitaxel induces fewer hematopoietic and cardiovascular complications than bioequivalent doses of Taxol. International Journal of Oncology. 53 (3), 1105-1117 (2018).
