אנליזה של מולקולה בודדת של מנועי משפחת קינסין-3 מטוהרים מסוג Sf9
Summary
מחקר זה מפרט טיהור של KIF1A(1-393LZ), חבר במשפחת קינזין-3, באמצעות מערכת ביטוי Sf9-baculovirus. ניתוח החלקה חד-מולקולתית ורב-מנועית במבחנה של מנועים מטוהרים אלה הפגין תכונות תנועתיות חזקות הדומות למנועים של ליזאט תאי יונקים. לפיכך, מערכת Sf9-baculovirus היא מקובלת להביע ולטהר חלבון מוטורי של עניין.
Abstract
סביבה תאית מורכבת מציבה אתגרים לניתוח תנועתיות של מולקולה בודדת. עם זאת, ההתקדמות בטכניקות ההדמיה שיפרה את המחקרים על מולקולות בודדות וצברה פופולריות עצומה באיתור והבנה של ההתנהגות הדינמית של מולקולות המתויגות על-ידי פלואורסצנט. במאמר זה נתאר שיטה מפורטת למחקרי מולקולה בודדת במבחנה של מנועים ממשפחת קינסין-3 באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת (TIRF). Kinesin-3 היא משפחה גדולה הממלאת תפקידים קריטיים בתפקודים תאיים ופיזיולוגיים, החל מהובלת מטענים תוך-תאיים, דרך חלוקת תאים ועד להתפתחות. הראינו בעבר שמנועי קינזין-3 דימריים פעילים באופן מכונן מפגינים תנועתיות מהירה וסופר-מעבדית עם זיקה מיקרוטובולית גבוהה ברמת המולקולה הבודדת באמצעות ליזטים תאיים שהוכנו על ידי ביטוי מוטורי בתאי יונקים. המעבדה שלנו חוקרת מנועי קינסין-3 ומנגנוני הוויסות שלהם תוך שימוש בגישות תאיות, ביוכימיות וביופיזיקליות, ומחקרים כאלה דורשים חלבונים מטוהרים בקנה מידה גדול. ביטוי וטיהור של מנועים אלה באמצעות תאי יונקים יהיה יקר וגוזל זמן, בעוד שביטוי במערכת ביטוי פרוקריוטית הביא לחלבון מצטבר ולא פעיל באופן משמעותי. כדי להתגבר על המגבלות שמציבות מערכות טיהור חיידקים וליזה של תאי יונקים, הקמנו מערכת ביטוי חזקה של Sf9-baculovirus כדי לבטא ולטהר את המנועים האלה. מנועי הקינזין-3 מתויגים באופן סופי ב-C עם חלבונים פלואורסצנטיים בעלי 3 טנדם (3xmCitirine או 3xmCit) המספקים אותות משופרים והפחתת הלבנה. ניתוח החלקה חד-מולקולתית ורב-מנועית במבחנה של חלבונים מטוהרים מדגם Sf9 מראה כי מנועי קינזין-3 הם מהירים וסופר-מעבדים בדומה למחקרים קודמים שלנו שהשתמשו בליסאטות של תאי יונקים. יישומים אחרים המשתמשים במבחנים אלה כוללים ידע מפורט על תנאי אוליגומרים של מנועים, שותפים מחייבים ספציפיים המקבילים למחקרים ביוכימיים, ומצבם הקיני.
Introduction
סביבת תאים צפופה מאוד מציבה אתגרים רבים במיון חלבונים ומולקולות מיועדים. עומס עבודה אינטנסיבי זה של ארגון והפצה מרחבית-טמפורלית של מולקולות בתוך הציטופלסמה מתאפשר על ידי מנועים מולקולריים ומסלולים ציטוסקטליים. מנועים מולקולריים הם האנזימים שמבצעים הידרוליזה של מטבעות האנרגיה כגון ATP ומנצלים אנרגיה זו במהלך תנועה ויצירת כוח1. בהתבסס על הדמיון ברצף חומצות האמינו, קינסינים מקובצים ל-14 משפחות ולמרות הדמיון הזה, כל מנוע תורם באופן ייחודי לתפקוד התא. מנועי משפחת קינסין-3 מהווים את אחד הגדולים ביותר, הכולל חמש תת-משפחות (KIF1, KIF13, KIF14, KIF16 ו- KIF28)2, הקשורות למגוון תפקודים תאיים ופיזיולוגיים, כולל הובלת שלפוחית, איתות, מיטוזה, הגירה גרעינית ופיתוח 3,4,5. פגיעה בתפקוד ההובלה של קינזין-3 כרוכה בהפרעות נוירודגנרטיביות רבות, פגמים התפתחותיים ומחלות סרטן 6,7,8,9.
עבודות אחרונות הראו כי מנועי קינזין-3 הם מונומרים אך עוברים דימריזציה הנגרמת על ידי מטען וגורמים לתנועתיות מהירה וסופר-תהליכית בהשוואה לקינסיןקונבנציונלי 10,11,12,13. האפיון הביוכימי והביופיזי שלהם זקוק לכמות גדולה של חלבונים מטוהרים ופעילים. עם זאת, הייצור שלהם במערכת הביטוי הפרוקריוטית הביא למנועים לא פעילים או מצטברים, ככל הנראה בשל סינתזת חלבונים, קיפול ושינוי מכונות 14,15,16,17,18 שאינן תואמות. כדי לעקוף מגבלות כאלה ולהגדיל את התשואה, כאן הקמנו מערכת ביטוי חזקה Sf9-baculovirus כדי לבטא ולטהר את המנועים האלה.
מערכת הביטוי של baculovirus משתמשת בקווי תאי חרקים Sf9 כמערכת מארחת לביטוי חלבון רקומביננטי אאוקריוטי בעל תפוקה גבוהה19,20. ל-Baculovirus יש מקדם פוליהדרין חזק המסייע בביטוי גנים הטרולוגיים ובייצור חלבונים רקומביננטיים מסיסים17. בשל עלותו החסכונית, בטיחותו לטיפול וכמות גבוהה של ביטוי חלבון פעיל, הוא הפך לכלי רב עוצמה21. כדי לבטא חלבון בעל עניין, צעד מפתח הוא ליצור בסיס רקומביננטי. מכיוון שערכות ייצור הבקמיד הזמינות מסחרית הן יקרות ואנחנו נעבוד עם דגימות נוספות, פיתחנו פרוטוקול פנימי לתוספות גדולות וקטנות של מנועי קינזין-3 לתוך bacmids. מנועי קינזין-3 מטוהרים Sf9 שימשו לאפיון תכונות גלישה של מיקרוטובול מיקרו-מבחנה חד-מבנית ורב-מנועית באמצעות מיקרוסקופיית השתקפות פלואורסצנטית פנימית כוללת (TIRF). מנועים מתויגים באופן סופי C עם מולקולות פלואורסצנטיות 3-טנדם (3xmCit) כדי לספק אות משופר והפחתת הלבנת פוטו. בשל יחס אות לרעש מוגבר, פחות פוטוטוקסיות והדמיה סלקטיבית של אזור קטן מאוד קרוב לכיסוי, נעשה שימוש נרחב בהדמיית TIRF כדי לדמיין דינמיקה של חלבונים ברמת המולקולה הבודדת in vivo ו– in vitro.
מחקר זה דן בטיהור מנועי קינסין-3 על ידי שימוש במערכת ביטוי Sf9-baculovirus והדמיית מולקולה בודדת במבחנה וניתוח גלישה רב-מוטורית של מנועים באמצעות מיקרוסקופיית TIRF. בסך הכל, מחקר זה מראה כי תכונות התנועתיות של מנועים מטוהרים Sf9 זהות לאלה של מנועים שהוכנו מליסאטות של תאי יונקים. לפיכך, אנו מאמינים כי ניתן להתאים את מערכת Sf9-baculovirus כדי לבטא ולטהר כל חלבון מוטורי בעל עניין.
Protocol
Representative Results
Discussion
מערכת הביטוי Sf9-baculovirus היא אחת השיטות הרב-תכליתיות והמוצלחות ביותר לייצור חלבונים בתפוקה גבוהה 19,36,37. יכולת השינוי לאחר ההעברה של תאי Sf9 דומה מאוד למערכת היונקים15. חסרון ניכר בשימוש במערכת זו הוא שהיא איטית ורגישה לזיהום. אחד ה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
V.S. ו- P.S. מודים לפרופ’ קריסטן ג’יי ורהי (אוניברסיטת מישיגן, אן ארבור, מישיגן, ארה”ב) ולפרופ’ רופ מאליק (המכון ההודי לטכנולוגיה בומביי (IITB), מומבאי, הודו) על תמיכתם ללא תנאי לאורך כל המחקר. נ.ב. מודה לד”ר סיבפריה קירובקאראן על תמיכתה לאורך כל הפרויקט. V.S. מאשרת מימון באמצעות DBT (מענק מס’: BT/PR15214/BRB/10/1449/2015 ו-BT/RLF/Re-entry/45/2015) ו-DST-SERB (מענק מס’: ECR/2016/000913). P.K.N מאשרת את ICMR למימון (מענק מס’ 5/13/2019/NCD-III). נ.ב. מאשרת מימון משעון הקיץ (מענק מס’: SR/WOS-A/LS-73/2017). D.J.S מכיר במלגה מ- IIT Gandhinagar.
Materials
| Sf9 culture and transfection materials | |||
| anti-FLAG M2 affinity | Biolegend | 651502 | For motility purification |
| Aprotinin | Sigma | A6279 | For motility assay and purification |
| Cellfectin | Invitrogen | 10362100 | For Sf9 transfection |
| DTT | Sigma | D5545 | For motility assay mixture |
| FLAG peptide | Sigma | F3290 | For motility purification |
| Glycerol | Sigma | G5516 | For motility purification |
| HEPES | Sigma | H3375 | Preparing lysing Sf9 cells |
| IGEPAL CA 630 | Sigma | I8896 | Preparing lysing buffer for Sf9 cells |
| KCl | Sigma | P9541 | For motility purification |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | For motility assay and purification |
| MgCl2 | Sigma | M2670 | For preparing lysis buffer |
| NaCl | Sigma | S7653 | For preparing lysis buffer |
| PMSF | Sigma | P7626 | For motility purification |
| Sf9 cells | Kind gift from Dr. Thomas Pucadyil (Indian Institute of Science Education and Research, Pune, India). | For baculovirs expression and purification | |
| Sf9 culture bottles | Thermo Scientific | 4115-0125 | For suspension culture |
| Sf-900/SFM medium (1X) | Thermo Scientific | 10902-096 -500ml | For culturing Sf9 cells |
| Sucrose | Sigma | S1888 | Preparing lysing buffer for Sf9 cells |
| Unsupplemented Grace’s media | Thermo Scientific | 11595030 -500ml | For Sf9 transfection |
| Mirotubule Polymerization and Single molecule assay materails | |||
| ATP | Sigma | A2647 | For motility and gliding assay |
| BSA | Sigma | A2153 | For blocking motility chamber |
| Catalase | Sigma | C9322 | For motility and gliding assay |
| DMSO | Sigma | D5879 | For dissolving Rhodamine |
| EGTA | Sigma | 3777 | For preparing buffers |
| Glucose | Sigma | G7021 | For motility and gliding assay |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133 | For motility and gliding assay |
| GTP | Sigma | G8877 | For microtubule polymerization |
| KOH | Sigma | P1767 | Preparing PIPES buffer pH 6.9 |
| PIPES | Sigma | P6757 | For motility and gliding assay |
| Microtubule gliding assay materials | |||
| 26G needle | Dispovan | For shearing microtubules | |
| Casein | Sigma | C3400 | For microtubule glidning assay |
| GFP nanobodies | Gift from Dr. Sivaraj Sivaramakrishnan (University of Minnesota, USA) | For attaching motors to the coverslip | |
| Rhodamine | Thermo Scientific | 46406 | For preparing labelling tubulin |
| Microscope and other instruments | |||
| 0.5ml, 1.5 and 2-ml microcentrifuge tubes | Eppendorf | For Sf9 culture and purification | |
| 10ml disposable sterile pipettes | Eppendorf | For Sf9 culture and purification | |
| 10ul, 200ul, 1ml micropipette tips | Eppendorf | For Sf9 culture and purification | |
| 15ml concal tubes | Eppendorf | For Sf9 culture and purification | |
| 35mm cell culture dish | Cole Palmer | 15179-39 | For Sf9 culture |
| Balance | Sartorious | 0.01g-300g | |
| Benchtop orbial shaking incubator | REMI | For Sf9 suspenculture at 28oC | |
| Camera | EMCCD Andor iXon Ultra 897 | For TIRF imaging and acquesition | |
| Double sided tape | Scotch | For making motility chamber | |
| Glass coverslip | Fisherfinest | 12-548-5A | size; 22X30 |
| Glass slide | Blue Star | For making motility chamber | |
| Heating block | Neuation | Dissolving paraffin wax | |
| Inverted microscope | Nikon Eclipse Ti- U | To check protein expression | |
| Lasers | 488nm (100mW) | For TIRF imaging | |
| Liquid nitrogen | For sample freezing and storage | ||
| Microcapillary loading tip | Eppendorf | EP022491920 | For shearing microtubules |
| Microscope | Nikon Eclipse Ti2-E with DIC set up | For TIRF imaging | |
| Mini spin | Genetix, BiotechAsia Pvt.Ltd | For quick spin | |
| Objective | 100X TIRF objective with 1.49NA oil immersion | For TIRF imaging | |
| Optima UltraCentrifuge XE | Beckman Coulter | For protein purification | |
| Parafilm | Eppendorf | ||
| pH-meter | Corning | Coring 430 | To adjust pH |
| Pipette-boy | VWR | For Sf9 culture and purification | |
| Sorvall Legend Micro 21 | Thermo Scientific | For protein purification | |
| Sorvall ST8R centrifuge | Thermo Scientific | Protein purification | |
| ThermoMixer | Eppendorf | For microtubule polymerization | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman coulter | SW60Ti rotor | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman | 5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm | |
| Vortex mixer | Neuation | Sample mixing | |
| Wax | Sigma | V001228 | To seal motility chamber |
References
- Vale, R. D. The molecular motor toolbox for intracellular transport. Cell. 112, 467-480 (2003).
- Miki, H., Okada, Y., Hirokawa, N. Analysis of the kinesin superfamily: insights into structure and function. Trends in Cell Biology. 15 (9), 467-476 (2005).
- Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).
- Hirokawa, N., Takemura, R. Molecular motors and mechanisms of directional transport in neurons. Nature Reviews Neuroscience. 6 (3), 201-214 (2005).
- Patel, N. M., et al. KIF13A motors are regulated by Rab22A to function as weak dimers inside the cell. Scientific Advances. 7 (6), (2021).
- Franker, M. A., Hoogenraad, C. C. Microtubule-based transport – basic mechanisms, traffic rules and role in neurological pathogenesis. Journal of Cellular Science. 126, 2319-2329 (2013).
- Gunawardena, S., Anderson, E. N., White, J. Axonal transport and neurodegenerative disease: vesicle-motor complex formation and their regulation. Degernative Neurological and Neuromuscular Disease. 4, 29-47 (2014).
- Rath, O., Kozielski, F. Kinesins and cancer. Nature Reviews Cancer. 12 (8), 527-539 (2012).
- Wang, Z. Z., et al. KIF14 promotes cell proliferation via activation of Akt and is directly targeted by miR-200c in colorectal cancer. International Journal of Oncology. 53 (5), 1939-1952 (2018).
- Guo, S. K., Shi, X. X., Wang, P. Y., Xie, P. Run length distribution of dimerized kinesin-3 molecular motors: comparison with dimeric kinesin-1. Scientific Reports. 9 (1), 16973 (2019).
- Scarabelli, G., et al. Mapping the processivity determinants of the Kinesin-3 motor domain. Biophysical Journal. 109 (8), 1537-1540 (2015).
- Soppina, V., et al. Dimerization of mammalian kinesin-3 motors results in superprocessive motion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 5562-5567 (2014).
- Soppina, V., Verhey, K. J. The family-specific K-loop influences the microtubule on-rate but not the superprocessivity of kinesin-3 motors. Molecular Biology Cell. 25 (14), 2161-2170 (2014).
- Soppina, V., et al. Kinesin-3 motors are fine-tuned at the molecular level to endow distinct mechanical outputs. BMC Biology. , (2022).
- Korten, T., Chaudhuri, S., Tavkin, E., Braun, M., Diez, S. Kinesin-1 Expressed in insect cells improves microtubule in vitro gliding performance, long-term stability and guiding efficiency in nanostructures. IEEE Transactions on Nanobioscience. 15 (1), 62-69 (2016).
- Schmidt, F. R. Recombinant expression systems in the pharmaceutical industry. Applied Microbiology and Biotechnology. 65 (4), 363-372 (2004).
- Kurland, C., Gallant, J. Errors of heterologous protein expression. Current Opinions in Biotechnology. 7 (5), 489-493 (1996).
- Tao, L., Scholey, J. M. Purification and assay of mitotic motors. Methods. 51 (2), 233-241 (2010).
- Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature Biotechnology. 23 (5), 567-575 (2005).
- Felberbaum, R. S. The baculovirus expression vector system: A commercial manufacturing platform for viral vaccines and gene therapy vectors. Biotechnology Journal. 10 (5), 702-714 (2015).
- Kumar, N., Pandey, D., Halder, A., Kumar, D., Gong, C. . Trends in Insect Molecular Biology and Biotechnology. , 163-191 (2018).
- Nagano, T. Development of fluorescent probes for bioimaging applications. Proceedings of the Japan Academy. Series B. Physical and Biological Sciences. 86 (8), 837-847 (2010).
- Hassan, M., Klaunberg, B. A. Biomedical applications of fluorescence imaging in vivo. Comparative Medicine. 54 (6), 635-644 (2004).
- Yang, Z., Samanta, S., Yan, W., Yu, B., Qu, J. Super-resolution microscopy for biological imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 3233, 23-43 (2021).
- Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
- Waters, J. C. Live-cell fluorescence imaging. Methods in Cell Biology. 114, 125-150 (2013).
- Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).
- Wojtovich, A. P., Foster, T. H. Optogenetic control of ROS production. Redox Biology. 2, 368-376 (2014).
- Cai, D., Verhey, K. J., Meyhofer, E. Tracking single Kinesin molecules in the cytoplasm of mammalian cells. Biophysical Journal. 92 (12), 4137-4144 (2007).
- Bohm, K. J., Stracke, R., Baum, M., Zieren, M., Unger, E. Effect of temperature on kinesin-driven microtubule gliding and kinesin ATPase activity. FEBS Letters. 466, 59-62 (2000).
- Porter, M. E., et al. Characterization of the microtubule movement produced by sea urchin egg kinesin. The Journal of Biological Chemistry. 262 (6), 2794-2802 (1987).
- Muyldermans, S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).
- Verma, S., Kumar, N., Verma, V. Role of paclitaxel on critical nucleation concentration of tubulin and its effects thereof. Biochemical and Biophysical Research Communications. 478 (3), 1350-1354 (2016).
- Parness, J., Horwitz, S. B. Taxol binds to polymerized tubulin in vitro. Journal of Cell Biology. 91 (2), 479-487 (1981).
- Schiff, P. B., Fant, J., Horwitz, S. B. Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol. Nature. 277 (5698), 665-667 (1979).
- Kato, T., Kageshima, A., Suzuki, F., Park, E. Y. Expression and purification of human (pro)renin receptor in insect cells using baculovirus expression system. Protein Expression and Purification. 58 (2), 242-248 (2008).
- Liu, F., Wu, X., Li, L., Liu, Z., Wang, Z. Use of baculovirus expression system for generation of virus-like particles: successes and challenges. Protein Expression and Purification. 90 (2), 104-116 (2013).
- Terpe, K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Applied Microbiology and Biotechnology. 60 (5), 523-533 (2003).
- Huang, S. T., et al. Liposomal paclitaxel induces fewer hematopoietic and cardiovascular complications than bioequivalent doses of Taxol. International Journal of Oncology. 53 (3), 1105-1117 (2018).
