Einzelmolekülanalyse von Sf9-gereinigten superprozessiven Motoren der Kinesin-3-Familie
Summary
Diese Studie beschreibt die Reinigung von KIF1A (1-393LZ), einem Mitglied der Kinesin-3-Familie, unter Verwendung des Sf9-Baculovirus-Expressionssystems. Die In-vitro-Einzelmolekül – und Multimotor-Gleitanalyse dieser gereinigten Motoren zeigte robuste Motilitätseigenschaften, die mit Motoren aus Säugetierzelllysat vergleichbar sind. Somit ist das Sf9-Baculovirus-System in der Lage, Motorprotein von Interesse zu exprimieren und zu reinigen.
Abstract
Eine komplexe zelluläre Umgebung stellt Herausforderungen für die Analyse der Einzelmolekülmotilität dar. Fortschritte in bildgebenden Verfahren haben jedoch Einzelmolekülstudien verbessert und immense Popularität bei der Erkennung und dem Verständnis des dynamischen Verhaltens fluoreszierender Moleküle erlangt. Hier beschreiben wir eine detaillierte Methode für In-vitro-Einzelmolekülstudien von Motoren der Kinesin-3-Familie unter Verwendung der TIRF-Mikroskopie (Total Internal Reflection Fluorescence). Kinesin-3 ist eine große Familie, die eine entscheidende Rolle bei zellulären und physiologischen Funktionen spielt, die vom intrazellulären Frachttransport über die Zellteilung bis hin zur Entwicklung reichen. Wir haben bereits gezeigt, dass konstitutiv aktive dimere Kinesin-3-Motoren eine schnelle und superprozessive Motilität mit hoher Mikrotubuli-Affinität auf Einzelmolekülebene unter Verwendung von Zelllysaten aufweisen, die durch Expression von Motoren in Säugetierzellen hergestellt werden. Unser Labor untersucht Kinesin-3-Motoren und ihre Regulationsmechanismen mit zellulären, biochemischen und biophysikalischen Ansätzen, und solche Studien erfordern gereinigte Proteine in großem Maßstab. Die Expression und Reinigung dieser Motoren mit Säugetierzellen wäre teuer und zeitaufwendig, während die Expression in einem prokaryotischen Expressionssystem zu einem signifikant aggregierten und inaktiven Protein führte. Um die Einschränkungen durch bakterielle Reinigungssysteme und Säugetierzelllysat zu überwinden, haben wir ein robustes Sf9-Baculovirus-Expressionssystem zur Expression und Reinigung dieser Motoren etabliert. Die Kinesin-3-Motoren sind C-terminal-markiert mit 3-Tandem-Fluoreszenzproteinen (3xmCitirin oder 3xmCit), die verbesserte Signale und verminderte Photobleiche liefern. In-vitro-Einzelmolekül – und Multimotor-Gleitanalysen von Sf9-gereinigten Proteinen zeigen, dass Kinesin-3-Motoren schnell und superprozessiv sind, ähnlich unseren früheren Studien mit Säugetierzelllysaten. Andere Anwendungen, die diese Assays verwenden, umfassen detaillierte Kenntnisse der Oligomerbedingungen von Motoren, spezifische Bindungspartner, die biochemische Studien parallelisieren, und deren kinetischer Zustand.
Introduction
Eine immens überfüllte Zellumgebung stellt viele Herausforderungen bei der Sortierung bestimmter Proteine und Moleküle dar. Diese intensive Arbeitsbelastung der Organisation und raumzeitlichen Verteilung von Molekülen innerhalb des Zytoplasmas wird durch molekulare Motoren und Zytoskelettspuren erleichtert. Molekulare Motoren sind die Enzyme, die die Energiewährungen wie ATP hydrolysieren und diese Energie während der Bewegung und Krafterzeugung nutzen1. Basierend auf der Ähnlichkeit der Aminosäuresequenz werden Kinesine in 14 Familien eingeteilt und trotz dieser Ähnlichkeit trägt jeder Motor einzigartig zur Funktion einer Zelle bei. Die Motoren der Kinesin-3-Familie bilden eine der größten und umfassen fünf Unterfamilien (KIF1, KIF13, KIF14, KIF16 und KIF28)2, die mit verschiedenen zellulären und physiologischen Funktionen verbunden sind, einschließlich Vesikeltransport, Signalübertragung, Mitose, Kernmigration und Entwicklung 3,4,5. Eine Beeinträchtigung der Kinesin-3-Transportfunktion ist mit vielen neurodegenerativen Erkrankungen, Entwicklungsdefekten und Krebserkrankungen verbunden 6,7,8,9.
Neuere Arbeiten haben gezeigt, dass Kinesin-3-Motoren Monomere sind, aber eine ladungsinduzierte Dimerisierung durchlaufen und im Vergleich zu herkömmlichen Kinesin10,11,12,13 zu einer schnellen und superprozessiven Motilität führen. Ihre biochemische und biophysikalische Charakterisierung benötigt eine große Menge an gereinigten, aktiven Proteinen. Ihre Produktion im prokaryotischen Expressionssystem führte jedoch zu inaktiven oder aggregierten Motoren, vermutlich aufgrund inkompatibler Proteinsynthese-, Faltungs- und Modifikationsmaschinerie 14,15,16,17,18. Um solche Einschränkungen zu umgehen und die Ausbeute zu erhöhen, haben wir hier ein robustes Sf9-Baculovirus-Expressionssystem etabliert, um diese Motoren zu exprimieren und zu reinigen.
Das Baculovirus-Expressionssystem verwendet Sf9-Insektenzelllinien als Wirtssystem für die eukaryotische rekombinante Proteinexpression mit hohem Durchsatz19,20. Baculovirus besitzt einen starken Polyhedrin-Promotor, der die heterologe Genexpression und die Produktion löslicher rekombinanter Proteine unterstützt17. Aufgrund seiner Kosteneffizienz, seiner sicheren Handhabung und seines hohen Anteils an aktiver Proteinexpression ist es zu einem leistungsstarken Werkzeug21 geworden. Um ein Protein von Interesse zu exprimieren, besteht ein wichtiger Schritt darin, ein rekombinantes Bakmid zu erzeugen. Da die kommerziell erhältlichen Bacmid-Generierungskits teuer sind und wir mit mehr Proben arbeiten werden, haben wir ein internes Protokoll für große und kleine Einsätze von Kinesin-3-Motoren in Bacmid entwickelt. Sf9-gereinigte Kinesin-3-Motoren wurden verwendet, um in vitro Einzelmolekül- und Multimotor-Mikrotubuli-Gleiteigenschaften mittels TIRF-Mikroskopie (Total Internal Reflection Fluoreszenz) zu charakterisieren. Motoren sind C-terminal-markiert mit 3-Tandem-fluoreszierenden Molekülen (3xmCit), um ein verbessertes Signal und eine verminderte Photobleiche zu liefern. Aufgrund des erhöhten Signal-Rausch-Verhältnisses, der geringeren Phototoxizität und der selektiven Bildgebung eines sehr kleinen Bereichs in der Nähe des Deckglases wurde die TIRF-Bildgebung häufig verwendet, um die Proteindynamik auf Einzelmolekülebene in vivo und in vitro zu visualisieren.
Diese Studie diskutiert die Reinigung von Kinesin-3-Motoren unter Verwendung des Sf9-Baculovirus-Expressionssystems und der In-vitro-Einzelmolekülbildgebung und der Multimotor-Gleitanalyse von Motoren mittels TIRF-Mikroskopie. Insgesamt zeigt diese Studie, dass die Motilitätseigenschaften von gereinigten Sf9-Motoren identisch sind mit denen von Motoren, die aus Säugetierzelllysaten hergestellt werden. Daher glauben wir, dass das Sf9-Baculovirus-System angepasst werden kann, um jedes Motorprotein von Interesse zu exprimieren und zu reinigen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Sf9-Baculovirus-Expressionssystem ist eine der vielseitigsten und erfolgreichsten Methoden zur Hochdurchsatz-Proteinproduktion 19,36,37. Die posttranslationale Modifikationsfähigkeit von Sf9-Zellen ist mit dem Säugetiersystem15 sehr vergleichbar. Ein wesentlicher Nachteil der Verwendung dieses Systems ist, dass es langsam und empfindlich gegenüber Verunreinigungen ist. Einer der kritischsten Schrit…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
V.S. und P.S. danken Prof. Kristen J. Verhey (University of Michigan, Ann Arbor, MI, USA) und Prof. Roop Mallik (Indian Institute of Technology Bombay (IITB), Mumbai, Indien) für ihre bedingungslose Unterstützung während der gesamten Studie. P.S. dankt Dr. Sivapriya Kirubakaran für ihre Unterstützung während des gesamten Projekts. V.S. erkennt die Finanzierung durch DBT (Fördernummer: BT/PR15214/BRB/10/1449/2015 und BT/RLF/Re-entry/45/2015) und DST-SERB (Fördernummer: ECR/2016/000913) an. P.K.N erkennt ICMR für die Finanzierung an (Zuschuss Nr. 5/13/13/2019/NCD-III). P.S. bestätigt die Finanzierung durch DST (Fördernummer: SR/WOS-A/LS-73/2017). D.J.S erkennt das Stipendium des IIT Gandhinagar an.
Materials
| Sf9 culture and transfection materials | |||
| anti-FLAG M2 affinity | Biolegend | 651502 | For motility purification |
| Aprotinin | Sigma | A6279 | For motility assay and purification |
| Cellfectin | Invitrogen | 10362100 | For Sf9 transfection |
| DTT | Sigma | D5545 | For motility assay mixture |
| FLAG peptide | Sigma | F3290 | For motility purification |
| Glycerol | Sigma | G5516 | For motility purification |
| HEPES | Sigma | H3375 | Preparing lysing Sf9 cells |
| IGEPAL CA 630 | Sigma | I8896 | Preparing lysing buffer for Sf9 cells |
| KCl | Sigma | P9541 | For motility purification |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | For motility assay and purification |
| MgCl2 | Sigma | M2670 | For preparing lysis buffer |
| NaCl | Sigma | S7653 | For preparing lysis buffer |
| PMSF | Sigma | P7626 | For motility purification |
| Sf9 cells | Kind gift from Dr. Thomas Pucadyil (Indian Institute of Science Education and Research, Pune, India). | For baculovirs expression and purification | |
| Sf9 culture bottles | Thermo Scientific | 4115-0125 | For suspension culture |
| Sf-900/SFM medium (1X) | Thermo Scientific | 10902-096 -500ml | For culturing Sf9 cells |
| Sucrose | Sigma | S1888 | Preparing lysing buffer for Sf9 cells |
| Unsupplemented Grace’s media | Thermo Scientific | 11595030 -500ml | For Sf9 transfection |
| Mirotubule Polymerization and Single molecule assay materails | |||
| ATP | Sigma | A2647 | For motility and gliding assay |
| BSA | Sigma | A2153 | For blocking motility chamber |
| Catalase | Sigma | C9322 | For motility and gliding assay |
| DMSO | Sigma | D5879 | For dissolving Rhodamine |
| EGTA | Sigma | 3777 | For preparing buffers |
| Glucose | Sigma | G7021 | For motility and gliding assay |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133 | For motility and gliding assay |
| GTP | Sigma | G8877 | For microtubule polymerization |
| KOH | Sigma | P1767 | Preparing PIPES buffer pH 6.9 |
| PIPES | Sigma | P6757 | For motility and gliding assay |
| Microtubule gliding assay materials | |||
| 26G needle | Dispovan | For shearing microtubules | |
| Casein | Sigma | C3400 | For microtubule glidning assay |
| GFP nanobodies | Gift from Dr. Sivaraj Sivaramakrishnan (University of Minnesota, USA) | For attaching motors to the coverslip | |
| Rhodamine | Thermo Scientific | 46406 | For preparing labelling tubulin |
| Microscope and other instruments | |||
| 0.5ml, 1.5 and 2-ml microcentrifuge tubes | Eppendorf | For Sf9 culture and purification | |
| 10ml disposable sterile pipettes | Eppendorf | For Sf9 culture and purification | |
| 10ul, 200ul, 1ml micropipette tips | Eppendorf | For Sf9 culture and purification | |
| 15ml concal tubes | Eppendorf | For Sf9 culture and purification | |
| 35mm cell culture dish | Cole Palmer | 15179-39 | For Sf9 culture |
| Balance | Sartorious | 0.01g-300g | |
| Benchtop orbial shaking incubator | REMI | For Sf9 suspenculture at 28oC | |
| Camera | EMCCD Andor iXon Ultra 897 | For TIRF imaging and acquesition | |
| Double sided tape | Scotch | For making motility chamber | |
| Glass coverslip | Fisherfinest | 12-548-5A | size; 22X30 |
| Glass slide | Blue Star | For making motility chamber | |
| Heating block | Neuation | Dissolving paraffin wax | |
| Inverted microscope | Nikon Eclipse Ti- U | To check protein expression | |
| Lasers | 488nm (100mW) | For TIRF imaging | |
| Liquid nitrogen | For sample freezing and storage | ||
| Microcapillary loading tip | Eppendorf | EP022491920 | For shearing microtubules |
| Microscope | Nikon Eclipse Ti2-E with DIC set up | For TIRF imaging | |
| Mini spin | Genetix, BiotechAsia Pvt.Ltd | For quick spin | |
| Objective | 100X TIRF objective with 1.49NA oil immersion | For TIRF imaging | |
| Optima UltraCentrifuge XE | Beckman Coulter | For protein purification | |
| Parafilm | Eppendorf | ||
| pH-meter | Corning | Coring 430 | To adjust pH |
| Pipette-boy | VWR | For Sf9 culture and purification | |
| Sorvall Legend Micro 21 | Thermo Scientific | For protein purification | |
| Sorvall ST8R centrifuge | Thermo Scientific | Protein purification | |
| ThermoMixer | Eppendorf | For microtubule polymerization | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman coulter | SW60Ti rotor | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman | 5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm | |
| Vortex mixer | Neuation | Sample mixing | |
| Wax | Sigma | V001228 | To seal motility chamber |
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