Analyse à molécule unique de moteurs de la famille Sf9 superprocessive kinésine-3 purifiée
Summary
Cette étude détaille la purification de KIF1A (1-393LZ), un membre de la famille des kinésines-3, à l’aide du système d’expression du baculovirus Sf9. L’analyse in vitro de glissement monomoléculaire et multimoteur de ces moteurs purifiés a montré des propriétés de motilité robustes comparables à celles des moteurs du lysat de cellules de mammifères. Ainsi, le système Sf9-baculovirus est susceptible d’exprimer et de purifier la protéine motrice d’intérêt.
Abstract
Un environnement cellulaire complexe pose des défis pour l’analyse de la motilité d’une seule molécule. Cependant, les progrès des techniques d’imagerie ont amélioré les études sur une seule molécule et ont acquis une immense popularité dans la détection et la compréhension du comportement dynamique des molécules marquées par fluorescence. Ici, nous décrivons une méthode détaillée pour les études in vitro à molécule unique des moteurs de la famille kinesine-3 à l’aide de la microscopie par fluorescence par réflexion interne totale (TIRF). La kinésine-3 est une grande famille qui joue un rôle essentiel dans les fonctions cellulaires et physiologiques allant du transport intracellulaire de la cargaison à la division cellulaire en passant par le développement. Nous avons montré précédemment que les moteurs de kinésine-3 dimérique constitutivement actifs présentent une motilité rapide et superprocessive avec une affinité microtubule élevée au niveau de la molécule unique en utilisant des lysats cellulaires préparés par moteur exprimant dans des cellules de mammifères. Notre laboratoire étudie les moteurs kinésine-3 et leurs mécanismes de régulation à l’aide d’approches cellulaires, biochimiques et biophysiques, et de telles études nécessitent des protéines purifiées à grande échelle. L’expression et la purification de ces moteurs à l’aide de cellules de mammifères seraient coûteuses et prendraient beaucoup de temps, tandis que l’expression dans un système d’expression procaryote entraînerait une protéine significativement agrégée et inactive. Pour surmonter les limites posées par les systèmes de purification bactérienne et le lysat de cellules de mammifères, nous avons mis en place un système robuste d’expression du baculovirus Sf9 pour exprimer et purifier ces moteurs. Les moteurs kinesin-3 sont marqués en C terminale avec des protéines fluorescentes 3-tandem (3xmCitirine ou 3xmCit) qui fournissent des signaux améliorés et une diminution du photoblanchiment. L’analyse in vitro de la molécule unique et du glissement multimoteur des protéines purifiées Sf9 démontre que les moteurs kinésine-3 sont rapides et superprocessifs, comme nos études précédentes utilisant des lysats de cellules de mammifères. D’autres applications utilisant ces tests comprennent une connaissance détaillée des conditions oligomères des moteurs, des partenaires de liaison spécifiques parallèles aux études biochimiques et leur état cinétique.
Introduction
Un environnement cellulaire immensément encombré pose de nombreux défis dans le tri des protéines et des molécules destinées. Cette charge de travail intense d’organisation et de distribution spatio-temporelle des molécules dans le cytoplasme est facilitée par les moteurs moléculaires et les pistes cytosquelettiques. Les moteurs moléculaires sont les enzymes qui hydrolysent les monnaies énergétiques telles que l’ATP et utilisent cette énergie pendant la génération de mouvement et de force1. Sur la base de la similitude de la séquence d’acides aminés, les kinésines sont regroupées en 14 familles et malgré cette similitude, chaque moteur contribue de manière unique au fonctionnement d’une cellule. Les moteurs de la famille Kinesin-3 constituent l’un des plus importants, comprenant cinq sous-familles (KIF1, KIF13, KIF14, KIF16 et KIF28)2, associées à diverses fonctions cellulaires et physiologiques, y compris le transport des vésicules, la signalisation, la mitose, la migration nucléaire et le développement 3,4,5. L’altération de la fonction de transport de la kinésine-3 implique de nombreux troubles neurodégénératifs, anomalies du développement et maladies cancéreuses 6,7,8,9.
Des travaux récents ont démontré que les moteurs kinésine-3 sont des monomères mais subissent une dimérisation induite par la cargaison et entraînent une motilité rapide et superprocessive par rapport à la kinésineconventionnelle 10,11,12,13. Leur caractérisation biochimique et biophysique nécessite une grande quantité de protéines actives purifiées. Cependant, leur production dans le système d’expression procaryote a entraîné des moteurs inactifs ou agrégés, probablement en raison de machines de synthèse de protéines, de repliement et de modificationincompatibles 14,15,16,17,18. Pour contourner ces limitations et augmenter le rendement, nous avons ici mis en place un système robuste d’expression du baculovirus Sf9 pour exprimer et purifier ces moteurs.
Le système d’expression du baculovirus utilise des lignées cellulaires d’insectes Sf9 comme système hôte pour l’expression de protéines recombinantes eucaryotes à haut débit19,20. Le baculovirus possède un puissant promoteur de polyèdrine qui aide à l’expression hétérologue des gènes et à la production de protéines recombinantes solubles17. En raison de son rapport coût-efficacité, de sa sécurité à manipuler et de sa grande quantité d’expression de protéines actives, il est devenu un outil puissant21. Pour exprimer une protéine d’intérêt, une étape clé consiste à générer un bacmide recombinant. Étant donné que les kits de génération de bacmide disponibles dans le commerce sont chers et que nous travaillerons avec plus d’échantillons, nous avons développé un protocole interne pour les inserts grands et petits de moteurs kinésine-3 dans les bacmides. Des moteurs kinésine-3 purifiés au Sf9 ont été utilisés pour caractériser in vitro les propriétés de glissement des microtubules monomoléculaires et multimoteurs à l’aide de la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF). Les moteurs sont marqués en C avec des molécules fluorescentes en tandem 3 (3xmCit) pour fournir un signal amélioré et une diminution du photoblanchiment. En raison de son rapport signal/bruit accru, de sa phototoxicité moindre et de l’imagerie sélective d’une très petite zone proche de la lamelle de couverture, l’imagerie TIRF a été largement utilisée pour visualiser la dynamique des protéines au niveau d’une seule molécule in vivo et in vitro.
Cette étude traite de la purification des moteurs de kinésine-3 en utilisant le système d’expression du baculovirus Sf9 et l’imagerie in vitro d’une seule molécule et l’analyse de glissement multimoteur des moteurs à l’aide de la microscopie TIRF. Dans l’ensemble, cette étude montre que les propriétés de motilité des moteurs purifiés Sf9 sont identiques à celles des moteurs préparés à partir de lysats de cellules de mammifères. Par conséquent, nous pensons que le système Sf9-baculovirus peut être adapté pour exprimer et purifier toute protéine motrice d’intérêt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le système d’expression du baculovirus Sf9 est l’une des méthodes les plus polyvalentes et les plus efficaces pour la production de protéines à haut débit 19,36,37. La capacité de modification post-traductionnelle des cellules Sf9 est très comparable à celle du système mammifère15. Un inconvénient considérable de l’utilisation de ce système est qu’il est lent et sensible à la contami…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
V.S. et P.S. remercient le Prof. Kristen J. Verhey (Université du Michigan, Ann Arbor, MI, USA) et le Prof. Roop Mallik (Indian Institute of Technology Bombay (IITB), Mumbai, Inde) pour leur soutien inconditionnel tout au long de l’étude. P.S. remercie le Dr Sivapriya Kirubakaran pour son soutien tout au long du projet. V.S. reconnaît le financement par le biais de DBT (subvention n° : BT/PR15214/BRB/10/1449/2015 et BT/RLF/Re-entry/45/2015) et DST-SERB (subvention n° : ECR/2016/000913). P.K.N remercie l’ICMR pour son financement (subvention n° 5/13/13/2019/NCD-III). P.S. reconnaît le financement de DST (Numéro de subvention: SR / WOS-A / LS-73/2017). D.J.S reconnaît la bourse de l’IIT Gandhinagar.
Materials
| Sf9 culture and transfection materials | |||
| anti-FLAG M2 affinity | Biolegend | 651502 | For motility purification |
| Aprotinin | Sigma | A6279 | For motility assay and purification |
| Cellfectin | Invitrogen | 10362100 | For Sf9 transfection |
| DTT | Sigma | D5545 | For motility assay mixture |
| FLAG peptide | Sigma | F3290 | For motility purification |
| Glycerol | Sigma | G5516 | For motility purification |
| HEPES | Sigma | H3375 | Preparing lysing Sf9 cells |
| IGEPAL CA 630 | Sigma | I8896 | Preparing lysing buffer for Sf9 cells |
| KCl | Sigma | P9541 | For motility purification |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | For motility assay and purification |
| MgCl2 | Sigma | M2670 | For preparing lysis buffer |
| NaCl | Sigma | S7653 | For preparing lysis buffer |
| PMSF | Sigma | P7626 | For motility purification |
| Sf9 cells | Kind gift from Dr. Thomas Pucadyil (Indian Institute of Science Education and Research, Pune, India). | For baculovirs expression and purification | |
| Sf9 culture bottles | Thermo Scientific | 4115-0125 | For suspension culture |
| Sf-900/SFM medium (1X) | Thermo Scientific | 10902-096 -500ml | For culturing Sf9 cells |
| Sucrose | Sigma | S1888 | Preparing lysing buffer for Sf9 cells |
| Unsupplemented Grace’s media | Thermo Scientific | 11595030 -500ml | For Sf9 transfection |
| Mirotubule Polymerization and Single molecule assay materails | |||
| ATP | Sigma | A2647 | For motility and gliding assay |
| BSA | Sigma | A2153 | For blocking motility chamber |
| Catalase | Sigma | C9322 | For motility and gliding assay |
| DMSO | Sigma | D5879 | For dissolving Rhodamine |
| EGTA | Sigma | 3777 | For preparing buffers |
| Glucose | Sigma | G7021 | For motility and gliding assay |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133 | For motility and gliding assay |
| GTP | Sigma | G8877 | For microtubule polymerization |
| KOH | Sigma | P1767 | Preparing PIPES buffer pH 6.9 |
| PIPES | Sigma | P6757 | For motility and gliding assay |
| Microtubule gliding assay materials | |||
| 26G needle | Dispovan | For shearing microtubules | |
| Casein | Sigma | C3400 | For microtubule glidning assay |
| GFP nanobodies | Gift from Dr. Sivaraj Sivaramakrishnan (University of Minnesota, USA) | For attaching motors to the coverslip | |
| Rhodamine | Thermo Scientific | 46406 | For preparing labelling tubulin |
| Microscope and other instruments | |||
| 0.5ml, 1.5 and 2-ml microcentrifuge tubes | Eppendorf | For Sf9 culture and purification | |
| 10ml disposable sterile pipettes | Eppendorf | For Sf9 culture and purification | |
| 10ul, 200ul, 1ml micropipette tips | Eppendorf | For Sf9 culture and purification | |
| 15ml concal tubes | Eppendorf | For Sf9 culture and purification | |
| 35mm cell culture dish | Cole Palmer | 15179-39 | For Sf9 culture |
| Balance | Sartorious | 0.01g-300g | |
| Benchtop orbial shaking incubator | REMI | For Sf9 suspenculture at 28oC | |
| Camera | EMCCD Andor iXon Ultra 897 | For TIRF imaging and acquesition | |
| Double sided tape | Scotch | For making motility chamber | |
| Glass coverslip | Fisherfinest | 12-548-5A | size; 22X30 |
| Glass slide | Blue Star | For making motility chamber | |
| Heating block | Neuation | Dissolving paraffin wax | |
| Inverted microscope | Nikon Eclipse Ti- U | To check protein expression | |
| Lasers | 488nm (100mW) | For TIRF imaging | |
| Liquid nitrogen | For sample freezing and storage | ||
| Microcapillary loading tip | Eppendorf | EP022491920 | For shearing microtubules |
| Microscope | Nikon Eclipse Ti2-E with DIC set up | For TIRF imaging | |
| Mini spin | Genetix, BiotechAsia Pvt.Ltd | For quick spin | |
| Objective | 100X TIRF objective with 1.49NA oil immersion | For TIRF imaging | |
| Optima UltraCentrifuge XE | Beckman Coulter | For protein purification | |
| Parafilm | Eppendorf | ||
| pH-meter | Corning | Coring 430 | To adjust pH |
| Pipette-boy | VWR | For Sf9 culture and purification | |
| Sorvall Legend Micro 21 | Thermo Scientific | For protein purification | |
| Sorvall ST8R centrifuge | Thermo Scientific | Protein purification | |
| ThermoMixer | Eppendorf | For microtubule polymerization | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman coulter | SW60Ti rotor | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman | 5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm | |
| Vortex mixer | Neuation | Sample mixing | |
| Wax | Sigma | V001228 | To seal motility chamber |
References
- Vale, R. D. The molecular motor toolbox for intracellular transport. Cell. 112, 467-480 (2003).
- Miki, H., Okada, Y., Hirokawa, N. Analysis of the kinesin superfamily: insights into structure and function. Trends in Cell Biology. 15 (9), 467-476 (2005).
- Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).
- Hirokawa, N., Takemura, R. Molecular motors and mechanisms of directional transport in neurons. Nature Reviews Neuroscience. 6 (3), 201-214 (2005).
- Patel, N. M., et al. KIF13A motors are regulated by Rab22A to function as weak dimers inside the cell. Scientific Advances. 7 (6), (2021).
- Franker, M. A., Hoogenraad, C. C. Microtubule-based transport – basic mechanisms, traffic rules and role in neurological pathogenesis. Journal of Cellular Science. 126, 2319-2329 (2013).
- Gunawardena, S., Anderson, E. N., White, J. Axonal transport and neurodegenerative disease: vesicle-motor complex formation and their regulation. Degernative Neurological and Neuromuscular Disease. 4, 29-47 (2014).
- Rath, O., Kozielski, F. Kinesins and cancer. Nature Reviews Cancer. 12 (8), 527-539 (2012).
- Wang, Z. Z., et al. KIF14 promotes cell proliferation via activation of Akt and is directly targeted by miR-200c in colorectal cancer. International Journal of Oncology. 53 (5), 1939-1952 (2018).
- Guo, S. K., Shi, X. X., Wang, P. Y., Xie, P. Run length distribution of dimerized kinesin-3 molecular motors: comparison with dimeric kinesin-1. Scientific Reports. 9 (1), 16973 (2019).
- Scarabelli, G., et al. Mapping the processivity determinants of the Kinesin-3 motor domain. Biophysical Journal. 109 (8), 1537-1540 (2015).
- Soppina, V., et al. Dimerization of mammalian kinesin-3 motors results in superprocessive motion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 5562-5567 (2014).
- Soppina, V., Verhey, K. J. The family-specific K-loop influences the microtubule on-rate but not the superprocessivity of kinesin-3 motors. Molecular Biology Cell. 25 (14), 2161-2170 (2014).
- Soppina, V., et al. Kinesin-3 motors are fine-tuned at the molecular level to endow distinct mechanical outputs. BMC Biology. , (2022).
- Korten, T., Chaudhuri, S., Tavkin, E., Braun, M., Diez, S. Kinesin-1 Expressed in insect cells improves microtubule in vitro gliding performance, long-term stability and guiding efficiency in nanostructures. IEEE Transactions on Nanobioscience. 15 (1), 62-69 (2016).
- Schmidt, F. R. Recombinant expression systems in the pharmaceutical industry. Applied Microbiology and Biotechnology. 65 (4), 363-372 (2004).
- Kurland, C., Gallant, J. Errors of heterologous protein expression. Current Opinions in Biotechnology. 7 (5), 489-493 (1996).
- Tao, L., Scholey, J. M. Purification and assay of mitotic motors. Methods. 51 (2), 233-241 (2010).
- Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature Biotechnology. 23 (5), 567-575 (2005).
- Felberbaum, R. S. The baculovirus expression vector system: A commercial manufacturing platform for viral vaccines and gene therapy vectors. Biotechnology Journal. 10 (5), 702-714 (2015).
- Kumar, N., Pandey, D., Halder, A., Kumar, D., Gong, C. . Trends in Insect Molecular Biology and Biotechnology. , 163-191 (2018).
- Nagano, T. Development of fluorescent probes for bioimaging applications. Proceedings of the Japan Academy. Series B. Physical and Biological Sciences. 86 (8), 837-847 (2010).
- Hassan, M., Klaunberg, B. A. Biomedical applications of fluorescence imaging in vivo. Comparative Medicine. 54 (6), 635-644 (2004).
- Yang, Z., Samanta, S., Yan, W., Yu, B., Qu, J. Super-resolution microscopy for biological imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 3233, 23-43 (2021).
- Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
- Waters, J. C. Live-cell fluorescence imaging. Methods in Cell Biology. 114, 125-150 (2013).
- Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).
- Wojtovich, A. P., Foster, T. H. Optogenetic control of ROS production. Redox Biology. 2, 368-376 (2014).
- Cai, D., Verhey, K. J., Meyhofer, E. Tracking single Kinesin molecules in the cytoplasm of mammalian cells. Biophysical Journal. 92 (12), 4137-4144 (2007).
- Bohm, K. J., Stracke, R., Baum, M., Zieren, M., Unger, E. Effect of temperature on kinesin-driven microtubule gliding and kinesin ATPase activity. FEBS Letters. 466, 59-62 (2000).
- Porter, M. E., et al. Characterization of the microtubule movement produced by sea urchin egg kinesin. The Journal of Biological Chemistry. 262 (6), 2794-2802 (1987).
- Muyldermans, S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).
- Verma, S., Kumar, N., Verma, V. Role of paclitaxel on critical nucleation concentration of tubulin and its effects thereof. Biochemical and Biophysical Research Communications. 478 (3), 1350-1354 (2016).
- Parness, J., Horwitz, S. B. Taxol binds to polymerized tubulin in vitro. Journal of Cell Biology. 91 (2), 479-487 (1981).
- Schiff, P. B., Fant, J., Horwitz, S. B. Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol. Nature. 277 (5698), 665-667 (1979).
- Kato, T., Kageshima, A., Suzuki, F., Park, E. Y. Expression and purification of human (pro)renin receptor in insect cells using baculovirus expression system. Protein Expression and Purification. 58 (2), 242-248 (2008).
- Liu, F., Wu, X., Li, L., Liu, Z., Wang, Z. Use of baculovirus expression system for generation of virus-like particles: successes and challenges. Protein Expression and Purification. 90 (2), 104-116 (2013).
- Terpe, K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Applied Microbiology and Biotechnology. 60 (5), 523-533 (2003).
- Huang, S. T., et al. Liposomal paclitaxel induces fewer hematopoietic and cardiovascular complications than bioequivalent doses of Taxol. International Journal of Oncology. 53 (3), 1105-1117 (2018).
