Bu çalışma, kinezin-3 ailesinin bir üyesi olan KIF1A’nın (1-393LZ) Sf9-bakülovirüs ekspresyon sistemi kullanılarak saflaştırılmasını detaylandırmaktadır. Bu saflaştırılmış motorların in vitro tek moleküllü ve çok motorlu kayma analizi, memeli hücre lizatından elde edilen motorlarla karşılaştırılabilir sağlam hareketlilik özellikleri sergilemiştir. Bu nedenle, Sf9-bakülovirüs sistemi, ilgilenilen motor proteini ifade etmek ve saflaştırmak için uygundur.
Karmaşık bir hücresel ortam, tek moleküllü hareketlilik analizi için zorluklar doğurur. Bununla birlikte, görüntüleme tekniklerindeki ilerleme, tek moleküllü çalışmaları geliştirmiş ve floresan etiketli moleküllerin dinamik davranışlarını tespit etmede ve anlamada büyük popülerlik kazanmıştır. Burada, Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) mikroskobu kullanılarak kinesin-3 ailesi motorların in vitro tek moleküllü çalışmaları için ayrıntılı bir yöntem açıklıyoruz. Kinesin-3, hücre içi kargo taşımacılığından hücre bölünmesine ve gelişime kadar değişen hücresel ve fizyolojik fonksiyonlarda kritik roller oynayan büyük bir ailedir. Yapısal olarak aktif dimerik kinezin-3 motorlarının, memeli hücrelerinde motor eksprese edilerek hazırlanan hücre lizatlarını kullanarak tek molekül düzeyinde yüksek mikrotübül afinitesi ile hızlı ve süperprosesik hareketlilik sergilediğini daha önce göstermiştik. Laboratuvarımız hücresel, biyokimyasal ve biyofiziksel yaklaşımlar kullanarak kinesin-3 motorlarını ve düzenleyici mekanizmalarını inceler ve bu tür çalışmalar büyük ölçekte saflaştırılmış proteinler gerektirir. Bu motorların memeli hücreleri kullanılarak ekspresyonu ve saflaştırılması pahalı ve zaman alıcı olurken, prokaryotik bir ekspresyon sistemindeki ekspresyon önemli ölçüde toplanmış ve inaktif protein ile sonuçlanmıştır. Bakteriyel saflaştırma sistemleri ve memeli hücre lizatının getirdiği sınırlamaların üstesinden gelmek için, bu motorları eksprese etmek ve saflaştırmak için sağlam bir Sf9-bakülovirüs ekspresyon sistemi kurduk. Kinesin-3 motorları, gelişmiş sinyaller sağlayan ve fotobeyazlatmayı azaltan 3-tandem floresan proteinleri (3xmCitirine veya 3xmCit) ile C-terminal olarak etiketlenmiştir. Sf9 saflaştırılmış proteinlerin in vitro tek moleküllü ve çok motorlu kayma analizi, kinezin-3 motorlarının memeli hücre lizatlarını kullanan önceki çalışmalarımıza benzer şekilde hızlı ve süperprosesik olduğunu göstermektedir. Bu testleri kullanan diğer uygulamalar, motorların oligomer koşulları, biyokimyasal çalışmalara paralel özel bağlanma ortakları ve kinetik durumları hakkında ayrıntılı bilgi içerir.
Son derece kalabalık bir hücre ortamı, kaderindeki proteinleri ve molekülleri sıralamada birçok zorluk ortaya çıkarmaktadır. Sitoplazma içindeki moleküllerin organizasyonu ve mekansal zamansal dağılımının bu yoğun iş yükü, moleküler motorlar ve sitoiskelet izleri tarafından kolaylaştırılmıştır. Moleküler motorlar, ATP gibi enerji para birimlerini hidrolize eden ve bu enerjiyi hareket ve kuvvet üretimisırasında kullanan enzimlerdir. Amino asit dizisi benzerliğine dayanarak, kinezinler 14 aileye ayrılır ve bu benzerliğe rağmen, her motor bir hücrenin işleyişine benzersiz bir şekilde katkıda bulunur. Kinesin-3 ailesi motorlar, vezikül taşıma, sinyalleşme, mitoz, nükleer göç ve gelişim 3,4,5 dahil olmak üzere çeşitli hücresel ve fizyolojik işlevlerle ilişkili beş alt aileden (KIF1, KIF13, KIF14, KIF16 ve KIF28)2 oluşan en büyüklerden birini oluşturur. Kinezin-3 taşıma fonksiyonundaki bozulma birçok nörodejeneratif bozukluk, gelişimsel defekt ve kanser hastalığına etki eder 6,7,8,9.
Son zamanlarda yapılan çalışmalar, kinezin-3 motorlarının monomer olduğunu, ancak kargo kaynaklı dimerizasyona uğradığını ve geleneksel kinesin10,11,12,13’e kıyasla hızlı ve süperprosesik hareketliliğe neden olduğunu göstermiştir. Biyokimyasal ve biyofiziksel karakterizasyonları büyük miktarda saflaştırılmış, aktif proteine ihtiyaç duyar. Bununla birlikte, prokaryotik ekspresyon sistemindeki üretimleri, muhtemelen uyumsuz protein sentezi, katlama ve modifikasyon makineleri 14,15,16,17,18 nedeniyle inaktif veya agrega motorlarıyla sonuçlandı. Bu tür sınırlamaları aşmak ve verimi artırmak için, burada bu motorları ifade etmek ve saflaştırmak için sağlam bir Sf9-bakülovirüs ekspresyon sistemi kurduk.
Bakülovirüs ekspresyon sistemi, yüksek verimli ökaryotik rekombinant protein ekspresyonu 19,20 için konakçı sistem olarakSf9 böcek hücre hatlarını kullanır. Bakülovirüs, heterolog gen ekspresyonuna ve çözünür rekombinant proteinlerin üretimine yardımcı olan güçlü bir polihedrin promotörüne sahiptir17. Uygun maliyeti, kullanımı güvenli ve yüksek miktarda aktif protein ekspresyonu nedeniyle, güçlü bir araç haline gelmiştir21. İlgilenilen bir proteini ifade etmek için önemli bir adım, rekombinant bir bacmid üretmektir. Ticari olarak temin edilebilen bacmid üretim kitleri pahalı olduğundan ve daha fazla numune ile çalışacağımızdan kinezin-3 motorlarının hem büyük hem de küçük ekleri için bacmidlere şirket içi bir protokol geliştirdik. Sf9-saflaştırılmış kinesin-3 motorları, toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu kullanılarak in vitro tek moleküllü ve çok motorlu mikrotübül kayma özelliklerini karakterize etmek için kullanıldı. Motorlar, gelişmiş sinyal sağlamak ve fotobeyazlatmayı azaltmak için 3 tandem floresan molekülleri (3xmCit) ile C-terminal olarak etiketlenmiştir. Artan sinyal-gürültü oranı, daha az fototoksisite ve kapak kaymasına yakın çok küçük bir alanın seçici görüntülenmesi nedeniyle, TIRF görüntüleme, protein dinamiklerini in vivo ve in vitro olarak tek moleküllü seviyede görselleştirmek için yaygın olarak kullanılmaktadır.
Bu çalışmada, Sf9-bakülovirüs ekspresyon sistemi kullanılarak kinesin-3 motorlarının saflaştırılması ve TIRF mikroskobu kullanılarak motorların in vitro tek moleküllü görüntüleme ve çok motorlu kayma analizi tartışılmaktadır. Toplamda, bu çalışma, Sf9 saflaştırılmış motorların hareketlilik özelliklerinin, memeli hücre lizatlarından hazırlanan motorlarınkiyle aynı olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, Sf9-bakülovirüs sisteminin, ilgilenilen herhangi bir motor proteini ifade etmek ve saflaştırmak için uyarlanabileceğine inanıyoruz.
Sf9-bakülovirüs ekspresyon sistemi, yüksek verimli protein üretimi için en çok yönlü ve başarılı yöntemlerden biridir 19,36,37. Sf9 hücrelerinin posttranslasyonel modifikasyon yeteneği, memeli sistemi15 ile oldukça karşılaştırılabilir. Bu sistemi kullanmanın önemli bir dezavantajı, yavaş ve kontaminasyona karşı hassas olmasıdır. En kritik adımlardan biri, Sf9 hücrelerinde etk…
The authors have nothing to disclose.
VS ve PS, Prof. Kristen J. Verhey’e (Michigan Üniversitesi, Ann Arbor, MI, ABD) ve Prof. Roop Mallik’e (Hindistan Teknoloji Enstitüsü Bombay (IITB), Mumbai, Hindistan) çalışma boyunca koşulsuz destekleri için teşekkür eder. Not: Proje boyunca verdiği destek için Dr. Sivapriya Kirubakaran’a teşekkür eder. V.S., DBT (Hibe No.: BT/PR15214/BRB/10/1449/2015 ve BT/RLF/Re-entry/45/2015) ve DST-SERB (Hibe No.: ECR/2016/000913) aracılığıyla finansman sağlamaktadır. P.K.N, ICMR’yi finansman için kabul etmektedir (Hibe No. 5/13/13/2019/NCD-III). Not: DST’den fon kabul etmektedir (Hibe No.: SR/WOS-A/LS-73/2017). D.J.S, IIT Gandhinagar’ın bursunu kabul eder.
Sf9 culture and transfection materials | |||
anti-FLAG M2 affinity | Biolegend | 651502 | For motility purification |
Aprotinin | Sigma | A6279 | For motility assay and purification |
Cellfectin | Invitrogen | 10362100 | For Sf9 transfection |
DTT | Sigma | D5545 | For motility assay mixture |
FLAG peptide | Sigma | F3290 | For motility purification |
Glycerol | Sigma | G5516 | For motility purification |
HEPES | Sigma | H3375 | Preparing lysing Sf9 cells |
IGEPAL CA 630 | Sigma | I8896 | Preparing lysing buffer for Sf9 cells |
KCl | Sigma | P9541 | For motility purification |
Leupeptin | Sigma | L2884 | For motility assay and purification |
MgCl2 | Sigma | M2670 | For preparing lysis buffer |
NaCl | Sigma | S7653 | For preparing lysis buffer |
PMSF | Sigma | P7626 | For motility purification |
Sf9 cells | Kind gift from Dr. Thomas Pucadyil (Indian Institute of Science Education and Research, Pune, India). | For baculovirs expression and purification | |
Sf9 culture bottles | Thermo Scientific | 4115-0125 | For suspension culture |
Sf-900/SFM medium (1X) | Thermo Scientific | 10902-096 -500ml | For culturing Sf9 cells |
Sucrose | Sigma | S1888 | Preparing lysing buffer for Sf9 cells |
Unsupplemented Grace’s media | Thermo Scientific | 11595030 -500ml | For Sf9 transfection |
Mirotubule Polymerization and Single molecule assay materails | |||
ATP | Sigma | A2647 | For motility and gliding assay |
BSA | Sigma | A2153 | For blocking motility chamber |
Catalase | Sigma | C9322 | For motility and gliding assay |
DMSO | Sigma | D5879 | For dissolving Rhodamine |
EGTA | Sigma | 3777 | For preparing buffers |
Glucose | Sigma | G7021 | For motility and gliding assay |
Glucose oxidase | Sigma | G2133 | For motility and gliding assay |
GTP | Sigma | G8877 | For microtubule polymerization |
KOH | Sigma | P1767 | Preparing PIPES buffer pH 6.9 |
PIPES | Sigma | P6757 | For motility and gliding assay |
Microtubule gliding assay materials | |||
26G needle | Dispovan | For shearing microtubules | |
Casein | Sigma | C3400 | For microtubule glidning assay |
GFP nanobodies | Gift from Dr. Sivaraj Sivaramakrishnan (University of Minnesota, USA) | For attaching motors to the coverslip | |
Rhodamine | Thermo Scientific | 46406 | For preparing labelling tubulin |
Microscope and other instruments | |||
0.5ml, 1.5 and 2-ml microcentrifuge tubes | Eppendorf | For Sf9 culture and purification | |
10ml disposable sterile pipettes | Eppendorf | For Sf9 culture and purification | |
10ul, 200ul, 1ml micropipette tips | Eppendorf | For Sf9 culture and purification | |
15ml concal tubes | Eppendorf | For Sf9 culture and purification | |
35mm cell culture dish | Cole Palmer | 15179-39 | For Sf9 culture |
Balance | Sartorious | 0.01g-300g | |
Benchtop orbial shaking incubator | REMI | For Sf9 suspenculture at 28oC | |
Camera | EMCCD Andor iXon Ultra 897 | For TIRF imaging and acquesition | |
Double sided tape | Scotch | For making motility chamber | |
Glass coverslip | Fisherfinest | 12-548-5A | size; 22X30 |
Glass slide | Blue Star | For making motility chamber | |
Heating block | Neuation | Dissolving paraffin wax | |
Inverted microscope | Nikon Eclipse Ti- U | To check protein expression | |
Lasers | 488nm (100mW) | For TIRF imaging | |
Liquid nitrogen | For sample freezing and storage | ||
Microcapillary loading tip | Eppendorf | EP022491920 | For shearing microtubules |
Microscope | Nikon Eclipse Ti2-E with DIC set up | For TIRF imaging | |
Mini spin | Genetix, BiotechAsia Pvt.Ltd | For quick spin | |
Objective | 100X TIRF objective with 1.49NA oil immersion | For TIRF imaging | |
Optima UltraCentrifuge XE | Beckman Coulter | For protein purification | |
Parafilm | Eppendorf | ||
pH-meter | Corning | Coring 430 | To adjust pH |
Pipette-boy | VWR | For Sf9 culture and purification | |
Sorvall Legend Micro 21 | Thermo Scientific | For protein purification | |
Sorvall ST8R centrifuge | Thermo Scientific | Protein purification | |
ThermoMixer | Eppendorf | For microtubule polymerization | |
Ultracentrifuge rotor | Beckman coulter | SW60Ti rotor | |
Ultracentrifuge tubes | Beckman | 5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm | |
Vortex mixer | Neuation | Sample mixing | |
Wax | Sigma | V001228 | To seal motility chamber |