Summary

Sf9 Saflaştırılmış Süperprosesif Kinesin-3 Ailesi Motorlarının Tek Moleküllü Analizi

Published: July 27, 2022
doi:

Summary

Bu çalışma, kinezin-3 ailesinin bir üyesi olan KIF1A’nın (1-393LZ) Sf9-bakülovirüs ekspresyon sistemi kullanılarak saflaştırılmasını detaylandırmaktadır. Bu saflaştırılmış motorların in vitro tek moleküllü ve çok motorlu kayma analizi, memeli hücre lizatından elde edilen motorlarla karşılaştırılabilir sağlam hareketlilik özellikleri sergilemiştir. Bu nedenle, Sf9-bakülovirüs sistemi, ilgilenilen motor proteini ifade etmek ve saflaştırmak için uygundur.

Abstract

Karmaşık bir hücresel ortam, tek moleküllü hareketlilik analizi için zorluklar doğurur. Bununla birlikte, görüntüleme tekniklerindeki ilerleme, tek moleküllü çalışmaları geliştirmiş ve floresan etiketli moleküllerin dinamik davranışlarını tespit etmede ve anlamada büyük popülerlik kazanmıştır. Burada, Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) mikroskobu kullanılarak kinesin-3 ailesi motorların in vitro tek moleküllü çalışmaları için ayrıntılı bir yöntem açıklıyoruz. Kinesin-3, hücre içi kargo taşımacılığından hücre bölünmesine ve gelişime kadar değişen hücresel ve fizyolojik fonksiyonlarda kritik roller oynayan büyük bir ailedir. Yapısal olarak aktif dimerik kinezin-3 motorlarının, memeli hücrelerinde motor eksprese edilerek hazırlanan hücre lizatlarını kullanarak tek molekül düzeyinde yüksek mikrotübül afinitesi ile hızlı ve süperprosesik hareketlilik sergilediğini daha önce göstermiştik. Laboratuvarımız hücresel, biyokimyasal ve biyofiziksel yaklaşımlar kullanarak kinesin-3 motorlarını ve düzenleyici mekanizmalarını inceler ve bu tür çalışmalar büyük ölçekte saflaştırılmış proteinler gerektirir. Bu motorların memeli hücreleri kullanılarak ekspresyonu ve saflaştırılması pahalı ve zaman alıcı olurken, prokaryotik bir ekspresyon sistemindeki ekspresyon önemli ölçüde toplanmış ve inaktif protein ile sonuçlanmıştır. Bakteriyel saflaştırma sistemleri ve memeli hücre lizatının getirdiği sınırlamaların üstesinden gelmek için, bu motorları eksprese etmek ve saflaştırmak için sağlam bir Sf9-bakülovirüs ekspresyon sistemi kurduk. Kinesin-3 motorları, gelişmiş sinyaller sağlayan ve fotobeyazlatmayı azaltan 3-tandem floresan proteinleri (3xmCitirine veya 3xmCit) ile C-terminal olarak etiketlenmiştir. Sf9 saflaştırılmış proteinlerin in vitro tek moleküllü ve çok motorlu kayma analizi, kinezin-3 motorlarının memeli hücre lizatlarını kullanan önceki çalışmalarımıza benzer şekilde hızlı ve süperprosesik olduğunu göstermektedir. Bu testleri kullanan diğer uygulamalar, motorların oligomer koşulları, biyokimyasal çalışmalara paralel özel bağlanma ortakları ve kinetik durumları hakkında ayrıntılı bilgi içerir.

Introduction

Son derece kalabalık bir hücre ortamı, kaderindeki proteinleri ve molekülleri sıralamada birçok zorluk ortaya çıkarmaktadır. Sitoplazma içindeki moleküllerin organizasyonu ve mekansal zamansal dağılımının bu yoğun iş yükü, moleküler motorlar ve sitoiskelet izleri tarafından kolaylaştırılmıştır. Moleküler motorlar, ATP gibi enerji para birimlerini hidrolize eden ve bu enerjiyi hareket ve kuvvet üretimisırasında kullanan enzimlerdir. Amino asit dizisi benzerliğine dayanarak, kinezinler 14 aileye ayrılır ve bu benzerliğe rağmen, her motor bir hücrenin işleyişine benzersiz bir şekilde katkıda bulunur. Kinesin-3 ailesi motorlar, vezikül taşıma, sinyalleşme, mitoz, nükleer göç ve gelişim 3,4,5 dahil olmak üzere çeşitli hücresel ve fizyolojik işlevlerle ilişkili beş alt aileden (KIF1, KIF13, KIF14, KIF16 ve KIF28)2 oluşan en büyüklerden birini oluşturur. Kinezin-3 taşıma fonksiyonundaki bozulma birçok nörodejeneratif bozukluk, gelişimsel defekt ve kanser hastalığına etki eder 6,7,8,9.

Son zamanlarda yapılan çalışmalar, kinezin-3 motorlarının monomer olduğunu, ancak kargo kaynaklı dimerizasyona uğradığını ve geleneksel kinesin10,11,12,13’e kıyasla hızlı ve süperprosesik hareketliliğe neden olduğunu göstermiştir. Biyokimyasal ve biyofiziksel karakterizasyonları büyük miktarda saflaştırılmış, aktif proteine ihtiyaç duyar. Bununla birlikte, prokaryotik ekspresyon sistemindeki üretimleri, muhtemelen uyumsuz protein sentezi, katlama ve modifikasyon makineleri 14,15,16,17,18 nedeniyle inaktif veya agrega motorlarıyla sonuçlandı. Bu tür sınırlamaları aşmak ve verimi artırmak için, burada bu motorları ifade etmek ve saflaştırmak için sağlam bir Sf9-bakülovirüs ekspresyon sistemi kurduk.

Bakülovirüs ekspresyon sistemi, yüksek verimli ökaryotik rekombinant protein ekspresyonu 19,20 için konakçı sistem olarakSf9 böcek hücre hatlarını kullanır. Bakülovirüs, heterolog gen ekspresyonuna ve çözünür rekombinant proteinlerin üretimine yardımcı olan güçlü bir polihedrin promotörüne sahiptir17. Uygun maliyeti, kullanımı güvenli ve yüksek miktarda aktif protein ekspresyonu nedeniyle, güçlü bir araç haline gelmiştir21. İlgilenilen bir proteini ifade etmek için önemli bir adım, rekombinant bir bacmid üretmektir. Ticari olarak temin edilebilen bacmid üretim kitleri pahalı olduğundan ve daha fazla numune ile çalışacağımızdan kinezin-3 motorlarının hem büyük hem de küçük ekleri için bacmidlere şirket içi bir protokol geliştirdik. Sf9-saflaştırılmış kinesin-3 motorları, toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu kullanılarak in vitro tek moleküllü ve çok motorlu mikrotübül kayma özelliklerini karakterize etmek için kullanıldı. Motorlar, gelişmiş sinyal sağlamak ve fotobeyazlatmayı azaltmak için 3 tandem floresan molekülleri (3xmCit) ile C-terminal olarak etiketlenmiştir. Artan sinyal-gürültü oranı, daha az fototoksisite ve kapak kaymasına yakın çok küçük bir alanın seçici görüntülenmesi nedeniyle, TIRF görüntüleme, protein dinamiklerini in vivo ve in vitro olarak tek moleküllü seviyede görselleştirmek için yaygın olarak kullanılmaktadır.

Bu çalışmada, Sf9-bakülovirüs ekspresyon sistemi kullanılarak kinesin-3 motorlarının saflaştırılması ve TIRF mikroskobu kullanılarak motorların in vitro tek moleküllü görüntüleme ve çok motorlu kayma analizi tartışılmaktadır. Toplamda, bu çalışma, Sf9 saflaştırılmış motorların hareketlilik özelliklerinin, memeli hücre lizatlarından hazırlanan motorlarınkiyle aynı olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, Sf9-bakülovirüs sisteminin, ilgilenilen herhangi bir motor proteini ifade etmek ve saflaştırmak için uyarlanabileceğine inanıyoruz.

Protocol

1. Sf9 kültürü, transfeksiyonu ve virüs üretimi NOT: Sf9 hücrelerini, 28 °C’de herhangi bir antibiyotik/antimikotik olmadan 100 mL steril, tek kullanımlık konik şişede 30 mL Sf-900/SFM ortamında muhafaza edin. Süspansiyon kültürünü yörüngesel bir çalkalayıcıda 90 rpm’de tutun. CO2 ve nem bakımı gerekli değildir. Hücreler genellikle dördüncü günde 2.0 x 10 6 hücre / mL yoğunluğa ulaşmak için 0.5 x 106 hücre / m…

Representative Results

Aktif ve fonksiyonel rekombinant motor proteinleri Sf9-bakülovirüs ekspresyonunu kullanarak büyük ölçekte eksprese etmek ve saflaştırmak için, sistemin Sf9 hücrelerini enfekte etmek için bir kodlama dizisi taşıyan viral parçacıkların üretilmesine ihtiyacı vardır. Bunu başarmak için, Sf9 hücreleri KIF1A (1-393LZ)-3xmCit-FLAG kodlayan rekombinant bacmid ile transfekte edildi. 72 saat sonra, önemli bir hücre popülasyonu, genişlemiş hücreler ve çekirdeklerle yeşil floresan proteininin (mCitrine)…

Discussion

Sf9-bakülovirüs ekspresyon sistemi, yüksek verimli protein üretimi için en çok yönlü ve başarılı yöntemlerden biridir 19,36,37. Sf9 hücrelerinin posttranslasyonel modifikasyon yeteneği, memeli sistemi15 ile oldukça karşılaştırılabilir. Bu sistemi kullanmanın önemli bir dezavantajı, yavaş ve kontaminasyona karşı hassas olmasıdır. En kritik adımlardan biri, Sf9 hücrelerinde etk…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

VS ve PS, Prof. Kristen J. Verhey’e (Michigan Üniversitesi, Ann Arbor, MI, ABD) ve Prof. Roop Mallik’e (Hindistan Teknoloji Enstitüsü Bombay (IITB), Mumbai, Hindistan) çalışma boyunca koşulsuz destekleri için teşekkür eder. Not: Proje boyunca verdiği destek için Dr. Sivapriya Kirubakaran’a teşekkür eder. V.S., DBT (Hibe No.: BT/PR15214/BRB/10/1449/2015 ve BT/RLF/Re-entry/45/2015) ve DST-SERB (Hibe No.: ECR/2016/000913) aracılığıyla finansman sağlamaktadır. P.K.N, ICMR’yi finansman için kabul etmektedir (Hibe No. 5/13/13/2019/NCD-III). Not: DST’den fon kabul etmektedir (Hibe No.: SR/WOS-A/LS-73/2017). D.J.S, IIT Gandhinagar’ın bursunu kabul eder.

Materials

Sf9 culture and transfection materials
anti-FLAG M2 affinity Biolegend 651502 For motility purification
Aprotinin Sigma A6279 For motility assay and purification
Cellfectin Invitrogen 10362100 For Sf9 transfection
DTT Sigma D5545 For motility assay mixture
FLAG peptide Sigma F3290 For motility purification
Glycerol Sigma G5516 For motility purification
HEPES Sigma H3375 Preparing lysing Sf9 cells
IGEPAL CA 630 Sigma I8896 Preparing lysing buffer for Sf9 cells
KCl Sigma P9541 For motility purification
Leupeptin Sigma L2884 For motility assay and purification
MgCl2 Sigma M2670 For preparing lysis buffer
NaCl Sigma S7653 For preparing lysis buffer
PMSF Sigma P7626 For motility purification
Sf9 cells Kind gift from Dr. Thomas Pucadyil (Indian Institute of Science Education and Research, Pune, India). For baculovirs expression and purification
Sf9 culture bottles Thermo Scientific 4115-0125 For suspension culture
Sf-900/SFM medium (1X) Thermo Scientific 10902-096 -500ml For culturing Sf9 cells
Sucrose Sigma S1888 Preparing lysing buffer for Sf9 cells
Unsupplemented Grace’s media Thermo Scientific 11595030 -500ml For Sf9 transfection
Mirotubule Polymerization and Single molecule assay materails
ATP Sigma A2647 For motility and gliding assay
BSA Sigma A2153 For blocking motility chamber
Catalase Sigma C9322 For motility and gliding assay
DMSO Sigma D5879 For dissolving Rhodamine
EGTA Sigma 3777 For preparing buffers
Glucose Sigma G7021 For motility and gliding assay
Glucose oxidase Sigma G2133 For motility and gliding assay
GTP Sigma G8877 For microtubule polymerization
KOH Sigma P1767 Preparing PIPES buffer pH 6.9
PIPES Sigma P6757 For motility and gliding assay
Microtubule gliding assay materials
26G  needle Dispovan For shearing microtubules
Casein Sigma C3400 For microtubule glidning assay
GFP nanobodies Gift from Dr. Sivaraj Sivaramakrishnan (University of Minnesota, USA) For attaching motors to the coverslip
Rhodamine Thermo Scientific 46406 For preparing labelling tubulin
Microscope and other instruments
0.5ml, 1.5 and 2-ml microcentrifuge tubes Eppendorf For Sf9 culture and purification
10ml  disposable sterile pipettes Eppendorf For Sf9 culture and purification
10ul, 200ul, 1ml micropipette tips Eppendorf For Sf9 culture and purification
15ml concal tubes Eppendorf For Sf9 culture and purification
35mm cell culture dish Cole Palmer 15179-39 For Sf9 culture
Balance Sartorious 0.01g-300g
Benchtop orbial shaking incubator REMI For Sf9 suspenculture at 28oC
Camera EMCCD Andor iXon Ultra 897 For TIRF imaging and acquesition
Double sided tape Scotch For making motility chamber
Glass coverslip Fisherfinest 12-548-5A size; 22X30
Glass slide Blue Star For making motility chamber
Heating block Neuation Dissolving paraffin wax
Inverted microscope Nikon Eclipse Ti- U To check protein expression
Lasers 488nm (100mW) For TIRF imaging
Liquid nitrogen For sample freezing and storage
Microcapillary loading tip Eppendorf EP022491920 For shearing microtubules
Microscope Nikon Eclipse Ti2-E with DIC set up For TIRF imaging
Mini spin Genetix, BiotechAsia Pvt.Ltd For quick spin
Objective 100X TIRF objective with 1.49NA oil immersion For TIRF imaging
Optima UltraCentrifuge XE Beckman Coulter For protein purification
Parafilm Eppendorf
pH-meter Corning Coring 430 To adjust pH
Pipette-boy VWR For Sf9 culture and purification
Sorvall Legend Micro 21 Thermo Scientific For protein purification
Sorvall ST8R centrifuge Thermo Scientific Protein purification
ThermoMixer Eppendorf For microtubule polymerization
Ultracentrifuge rotor Beckman coulter SW60Ti rotor
Ultracentrifuge tubes Beckman 5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm
Vortex mixer Neuation Sample mixing
Wax Sigma V001228 To seal motility chamber

References

  1. Vale, R. D. The molecular motor toolbox for intracellular transport. Cell. 112, 467-480 (2003).
  2. Miki, H., Okada, Y., Hirokawa, N. Analysis of the kinesin superfamily: insights into structure and function. Trends in Cell Biology. 15 (9), 467-476 (2005).
  3. Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).
  4. Hirokawa, N., Takemura, R. Molecular motors and mechanisms of directional transport in neurons. Nature Reviews Neuroscience. 6 (3), 201-214 (2005).
  5. Patel, N. M., et al. KIF13A motors are regulated by Rab22A to function as weak dimers inside the cell. Scientific Advances. 7 (6), (2021).
  6. Franker, M. A., Hoogenraad, C. C. Microtubule-based transport – basic mechanisms, traffic rules and role in neurological pathogenesis. Journal of Cellular Science. 126, 2319-2329 (2013).
  7. Gunawardena, S., Anderson, E. N., White, J. Axonal transport and neurodegenerative disease: vesicle-motor complex formation and their regulation. Degernative Neurological and Neuromuscular Disease. 4, 29-47 (2014).
  8. Rath, O., Kozielski, F. Kinesins and cancer. Nature Reviews Cancer. 12 (8), 527-539 (2012).
  9. Wang, Z. Z., et al. KIF14 promotes cell proliferation via activation of Akt and is directly targeted by miR-200c in colorectal cancer. International Journal of Oncology. 53 (5), 1939-1952 (2018).
  10. Guo, S. K., Shi, X. X., Wang, P. Y., Xie, P. Run length distribution of dimerized kinesin-3 molecular motors: comparison with dimeric kinesin-1. Scientific Reports. 9 (1), 16973 (2019).
  11. Scarabelli, G., et al. Mapping the processivity determinants of the Kinesin-3 motor domain. Biophysical Journal. 109 (8), 1537-1540 (2015).
  12. Soppina, V., et al. Dimerization of mammalian kinesin-3 motors results in superprocessive motion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 5562-5567 (2014).
  13. Soppina, V., Verhey, K. J. The family-specific K-loop influences the microtubule on-rate but not the superprocessivity of kinesin-3 motors. Molecular Biology Cell. 25 (14), 2161-2170 (2014).
  14. Soppina, V., et al. Kinesin-3 motors are fine-tuned at the molecular level to endow distinct mechanical outputs. BMC Biology. , (2022).
  15. Korten, T., Chaudhuri, S., Tavkin, E., Braun, M., Diez, S. Kinesin-1 Expressed in insect cells improves microtubule in vitro gliding performance, long-term stability and guiding efficiency in nanostructures. IEEE Transactions on Nanobioscience. 15 (1), 62-69 (2016).
  16. Schmidt, F. R. Recombinant expression systems in the pharmaceutical industry. Applied Microbiology and Biotechnology. 65 (4), 363-372 (2004).
  17. Kurland, C., Gallant, J. Errors of heterologous protein expression. Current Opinions in Biotechnology. 7 (5), 489-493 (1996).
  18. Tao, L., Scholey, J. M. Purification and assay of mitotic motors. Methods. 51 (2), 233-241 (2010).
  19. Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature Biotechnology. 23 (5), 567-575 (2005).
  20. Felberbaum, R. S. The baculovirus expression vector system: A commercial manufacturing platform for viral vaccines and gene therapy vectors. Biotechnology Journal. 10 (5), 702-714 (2015).
  21. Kumar, N., Pandey, D., Halder, A., Kumar, D., Gong, C. . Trends in Insect Molecular Biology and Biotechnology. , 163-191 (2018).
  22. Nagano, T. Development of fluorescent probes for bioimaging applications. Proceedings of the Japan Academy. Series B. Physical and Biological Sciences. 86 (8), 837-847 (2010).
  23. Hassan, M., Klaunberg, B. A. Biomedical applications of fluorescence imaging in vivo. Comparative Medicine. 54 (6), 635-644 (2004).
  24. Yang, Z., Samanta, S., Yan, W., Yu, B., Qu, J. Super-resolution microscopy for biological imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 3233, 23-43 (2021).
  25. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  26. Waters, J. C. Live-cell fluorescence imaging. Methods in Cell Biology. 114, 125-150 (2013).
  27. Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).
  28. Wojtovich, A. P., Foster, T. H. Optogenetic control of ROS production. Redox Biology. 2, 368-376 (2014).
  29. Cai, D., Verhey, K. J., Meyhofer, E. Tracking single Kinesin molecules in the cytoplasm of mammalian cells. Biophysical Journal. 92 (12), 4137-4144 (2007).
  30. Bohm, K. J., Stracke, R., Baum, M., Zieren, M., Unger, E. Effect of temperature on kinesin-driven microtubule gliding and kinesin ATPase activity. FEBS Letters. 466, 59-62 (2000).
  31. Porter, M. E., et al. Characterization of the microtubule movement produced by sea urchin egg kinesin. The Journal of Biological Chemistry. 262 (6), 2794-2802 (1987).
  32. Muyldermans, S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).
  33. Verma, S., Kumar, N., Verma, V. Role of paclitaxel on critical nucleation concentration of tubulin and its effects thereof. Biochemical and Biophysical Research Communications. 478 (3), 1350-1354 (2016).
  34. Parness, J., Horwitz, S. B. Taxol binds to polymerized tubulin in vitro. Journal of Cell Biology. 91 (2), 479-487 (1981).
  35. Schiff, P. B., Fant, J., Horwitz, S. B. Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol. Nature. 277 (5698), 665-667 (1979).
  36. Kato, T., Kageshima, A., Suzuki, F., Park, E. Y. Expression and purification of human (pro)renin receptor in insect cells using baculovirus expression system. Protein Expression and Purification. 58 (2), 242-248 (2008).
  37. Liu, F., Wu, X., Li, L., Liu, Z., Wang, Z. Use of baculovirus expression system for generation of virus-like particles: successes and challenges. Protein Expression and Purification. 90 (2), 104-116 (2013).
  38. Terpe, K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Applied Microbiology and Biotechnology. 60 (5), 523-533 (2003).
  39. Huang, S. T., et al. Liposomal paclitaxel induces fewer hematopoietic and cardiovascular complications than bioequivalent doses of Taxol. International Journal of Oncology. 53 (3), 1105-1117 (2018).

Play Video

Cite This Article
Soppina, P., Shewale, D. J., Naik, P. K., Soppina, V. Single-Molecule Analysis of Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motors. J. Vis. Exp. (185), e63837, doi:10.3791/63837 (2022).

View Video