Summary

Одномолекулярный анализ очищенных сверхпроцессорных двигателей семейства кинезин-3 Sf9

Published: July 27, 2022
doi:

Summary

В этом исследовании подробно описывается очистка KIF1A (1-393LZ), члена семейства кинезин-3, с использованием системы экспрессии Sf9-бакуловируса. Анализ одномолекулярного и многомоторного скольжения in vitro этих очищенных двигателей показал надежные свойства подвижности, сопоставимые с двигателями из лизата клеток млекопитающих. Таким образом, Sf9-бакуловирусная система поддается экспрессии и очистке интересующего моторного белка.

Abstract

Сложная клеточная среда создает проблемы для анализа подвижности одной молекулы. Тем не менее, прогресс в методах визуализации улучшил исследования одной молекулы и приобрел огромную популярность в обнаружении и понимании динамического поведения флуоресцентных помеченных молекул. Здесь мы описываем подробный метод одномолекулярных исследований in vitro двигателей семейства кинезин-3 с использованием микроскопии тотальной флуоресценции внутреннего отражения (TIRF). Кинезин-3 – это большое семейство, которое играет решающую роль в клеточных и физиологических функциях, начиная от внутриклеточного транспорта груза до деления клеток и развития. Ранее мы показали, что конститутивно активные двигатели димерного кинезина-3 демонстрируют быструю и сверхпроцессорную подвижность с высоким сродством микротрубочек на одномолекулярном уровне с использованием клеточных лизатов, полученных путем экспрессии мотора в клетках млекопитающих. Наша лаборатория изучает двигатели кинезин-3 и их регуляторные механизмы с использованием клеточного, биохимического и биофизического подходов, и такие исследования требуют очищенных белков в больших масштабах. Экспрессия и очистка этих двигателей с использованием клеток млекопитающих были бы дорогостоящими и трудоемкими, тогда как экспрессия в системе экспрессии прокариот привела бы к значительно агрегированному и неактивному белку. Чтобы преодолеть ограничения, связанные с системами бактериальной очистки и лизатом клеток млекопитающих, мы создали надежную систему экспрессии Sf9-бакуловируса для экспрессии и очистки этих двигателей. Двигатели кинезин-3 имеют С-концевую маркировку 3-тандемными флуоресцентными белками (3xmCitirine или 3xmCit), которые обеспечивают улучшенные сигналы и уменьшенное фотоотбеливание. Анализ очищенных белков Sf9 in vitro с одной молекулой и несколькими двигателями скольжения показывает, что двигатели кинезин-3 быстры и сверхпроцессорны, сродни нашим предыдущим исследованиям с использованием лизатов клеток млекопитающих. Другие приложения, использующие эти анализы, включают подробное знание олигомерных условий двигателей, конкретных партнеров связывания, параллельных биохимическим исследованиям, и их кинетического состояния.

Introduction

Чрезвычайно переполненная клеточная среда создает много проблем при сортировке предназначенных белков и молекул. Этой интенсивной нагрузке на организацию и пространственно-временное распределение молекул внутри цитоплазмы способствуют молекулярные моторы и цитоскелетные следы. Молекулярные двигатели – это ферменты, которые гидролизуют энергетические валюты, такие как АТФ, и используют эту энергию во время движения и генерации силы1. Основываясь на сходстве аминокислотных последовательностей, кинезины сгруппированы в 14 семейств, и, несмотря на это сходство, каждый двигатель вносит уникальный вклад в функционирование клетки. Двигатели семейства Kinesin-3 составляют один из крупнейших, включающий пять подсемейств (KIF1, KIF13, KIF14, KIF16 и KIF28)2, связанных с различными клеточными и физиологическими функциями, включая перенос пузырьков, сигнализацию, митоз, ядерную миграцию и развитие 3,4,5. Нарушение транспортной функции кинезин-3 связано со многими нейродегенеративными расстройствами, дефектами развития и онкологическими заболеваниями 6,7,8,9.

Недавняя работа показала, что двигатели кинезин-3 являются мономерами, но подвергаются димеризации, вызванной грузом, и приводят к быстрой и сверхпроцессорной подвижности по сравнению с обычным кинезином 10,11,12,13. Их биохимическая и биофизическая характеристика нуждается в большом количестве очищенных, активных белков. Однако их производство в системе прокариотической экспрессии приводило к неактивным или агрегированным двигателям, предположительно из-за несовместимых механизмов синтеза, сворачивания и модификации белка 14,15,16,17,18. Чтобы обойти такие ограничения и увеличить урожайность, здесь мы создали надежную систему экспрессии Sf9-бакуловируса для экспрессии и очистки этих двигателей.

Система экспрессии бакуловируса использует клеточные линии насекомых Sf9 в качестве системы-хозяина для высокопроизводительной экспрессии эукариотического рекомбинантного белка19,20. Бакуловирус обладает сильным промотором многогранника, который помогает в гетерологичной экспрессии генов и производстве растворимых рекомбинантных белков17. Благодаря своей экономической эффективности, безопасности в обращении и большому количеству активной экспрессии белка, он стал мощным инструментом21. Чтобы выразить интересующий белок, ключевым шагом является генерация рекомбинантного bacmid. Поскольку коммерчески доступные комплекты генерации bacmid стоят дорого, и мы будем работать с большим количеством образцов, мы разработали собственный протокол для больших и маленьких вставок двигателей kinesin-3 в bacmids. Sf9-очищенные кинезин-3 двигатели были использованы для характеристики свойств скольжения in vitro одномолекулярных и многомоторных микротрубочек с использованием флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (TIRF). Двигатели имеют С-концевую маркировку 3-тандемными флуоресцентными молекулами (3xmCit) для обеспечения улучшенного сигнала и снижения фотоотбеливания. Благодаря повышенному соотношению сигнал/шум, меньшей фототоксичности и селективной визуализации очень небольшой области, близкой к крышке, визуализация TIRF широко используется для визуализации динамики белка на одномолекулярном уровне in vivo и in vitro.

В этом исследовании обсуждается очистка двигателей кинезин-3 с использованием системы экспрессии Sf9-бакуловируса и визуализации in vitro с одной молекулой и многомоторного скользящего анализа двигателей с использованием микроскопии TIRF. В целом, это исследование показывает, что свойства подвижности очищенных двигателей Sf9 идентичны свойствам двигателей, полученных из лизатов клеток млекопитающих. Следовательно, мы считаем, что система Sf9-бакуловируса может быть адаптирована для экспрессии и очистки любого моторного белка, представляющего интерес.

Protocol

1. Культура Sf9, трансфекция и генерация вирусов ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживать клетки Sf9 в 30 мл среды Sf-900/SFM в 100 мл стерильной, одноразовой конической колбы без какого-либо антибиотика/антимикотика при 28 °C. Храните культуру суспензии в орбитальном шейкере при 90 об/мин. По…

Representative Results

Для экспрессии и очистки активных и функциональных рекомбинантных моторных белков в больших масштабах с использованием экспрессии Sf9-бакуловируса системе необходима генерация вирусных частиц, стабильно несущих кодирующую последовательность для заражения клеток Sf9. Для достижения э?…

Discussion

Система экспрессии Sf9-бакуловируса является одним из наиболее универсальных и успешных методов высокопроизводительного производства белка 19,36,37. Способность к посттрансляционной модификации клеток Sf9 очень сопоставима с системой<sup c…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

V.S. и P.S. благодарят профессора Кристен Дж. Верхи (Мичиганский университет, Анн-Арбор, Мичиган, США) и профессора Роопа Маллика (Индийский технологический институт Бомбея (IITB), Мумбаи, Индия) за их безусловную поддержку на протяжении всего исследования. P.S. благодарит доктора Сиваприю Кирубакаран за поддержку на протяжении всего проекта. V.S. признает финансирование через DBT (Грант No: BT/PR15214/BRB/10/1449/2015 и BT/RLF/Re-entry/45/2015) и DST-SERB (Грант No: ECR/2016/000913). P.K.N признает ICMR за финансирование (Грант No 5/13/13/2019/NCD-III). P.S. признает финансирование из DST (Грант No: SR/WOS-A/LS-73/2017). D.J.S признает стипендию от IIT Gandhinagar.

Materials

Sf9 culture and transfection materials
anti-FLAG M2 affinity Biolegend 651502 For motility purification
Aprotinin Sigma A6279 For motility assay and purification
Cellfectin Invitrogen 10362100 For Sf9 transfection
DTT Sigma D5545 For motility assay mixture
FLAG peptide Sigma F3290 For motility purification
Glycerol Sigma G5516 For motility purification
HEPES Sigma H3375 Preparing lysing Sf9 cells
IGEPAL CA 630 Sigma I8896 Preparing lysing buffer for Sf9 cells
KCl Sigma P9541 For motility purification
Leupeptin Sigma L2884 For motility assay and purification
MgCl2 Sigma M2670 For preparing lysis buffer
NaCl Sigma S7653 For preparing lysis buffer
PMSF Sigma P7626 For motility purification
Sf9 cells Kind gift from Dr. Thomas Pucadyil (Indian Institute of Science Education and Research, Pune, India). For baculovirs expression and purification
Sf9 culture bottles Thermo Scientific 4115-0125 For suspension culture
Sf-900/SFM medium (1X) Thermo Scientific 10902-096 -500ml For culturing Sf9 cells
Sucrose Sigma S1888 Preparing lysing buffer for Sf9 cells
Unsupplemented Grace’s media Thermo Scientific 11595030 -500ml For Sf9 transfection
Mirotubule Polymerization and Single molecule assay materails
ATP Sigma A2647 For motility and gliding assay
BSA Sigma A2153 For blocking motility chamber
Catalase Sigma C9322 For motility and gliding assay
DMSO Sigma D5879 For dissolving Rhodamine
EGTA Sigma 3777 For preparing buffers
Glucose Sigma G7021 For motility and gliding assay
Glucose oxidase Sigma G2133 For motility and gliding assay
GTP Sigma G8877 For microtubule polymerization
KOH Sigma P1767 Preparing PIPES buffer pH 6.9
PIPES Sigma P6757 For motility and gliding assay
Microtubule gliding assay materials
26G  needle Dispovan For shearing microtubules
Casein Sigma C3400 For microtubule glidning assay
GFP nanobodies Gift from Dr. Sivaraj Sivaramakrishnan (University of Minnesota, USA) For attaching motors to the coverslip
Rhodamine Thermo Scientific 46406 For preparing labelling tubulin
Microscope and other instruments
0.5ml, 1.5 and 2-ml microcentrifuge tubes Eppendorf For Sf9 culture and purification
10ml  disposable sterile pipettes Eppendorf For Sf9 culture and purification
10ul, 200ul, 1ml micropipette tips Eppendorf For Sf9 culture and purification
15ml concal tubes Eppendorf For Sf9 culture and purification
35mm cell culture dish Cole Palmer 15179-39 For Sf9 culture
Balance Sartorious 0.01g-300g
Benchtop orbial shaking incubator REMI For Sf9 suspenculture at 28oC
Camera EMCCD Andor iXon Ultra 897 For TIRF imaging and acquesition
Double sided tape Scotch For making motility chamber
Glass coverslip Fisherfinest 12-548-5A size; 22X30
Glass slide Blue Star For making motility chamber
Heating block Neuation Dissolving paraffin wax
Inverted microscope Nikon Eclipse Ti- U To check protein expression
Lasers 488nm (100mW) For TIRF imaging
Liquid nitrogen For sample freezing and storage
Microcapillary loading tip Eppendorf EP022491920 For shearing microtubules
Microscope Nikon Eclipse Ti2-E with DIC set up For TIRF imaging
Mini spin Genetix, BiotechAsia Pvt.Ltd For quick spin
Objective 100X TIRF objective with 1.49NA oil immersion For TIRF imaging
Optima UltraCentrifuge XE Beckman Coulter For protein purification
Parafilm Eppendorf
pH-meter Corning Coring 430 To adjust pH
Pipette-boy VWR For Sf9 culture and purification
Sorvall Legend Micro 21 Thermo Scientific For protein purification
Sorvall ST8R centrifuge Thermo Scientific Protein purification
ThermoMixer Eppendorf For microtubule polymerization
Ultracentrifuge rotor Beckman coulter SW60Ti rotor
Ultracentrifuge tubes Beckman 5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm
Vortex mixer Neuation Sample mixing
Wax Sigma V001228 To seal motility chamber

References

  1. Vale, R. D. The molecular motor toolbox for intracellular transport. Cell. 112, 467-480 (2003).
  2. Miki, H., Okada, Y., Hirokawa, N. Analysis of the kinesin superfamily: insights into structure and function. Trends in Cell Biology. 15 (9), 467-476 (2005).
  3. Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).
  4. Hirokawa, N., Takemura, R. Molecular motors and mechanisms of directional transport in neurons. Nature Reviews Neuroscience. 6 (3), 201-214 (2005).
  5. Patel, N. M., et al. KIF13A motors are regulated by Rab22A to function as weak dimers inside the cell. Scientific Advances. 7 (6), (2021).
  6. Franker, M. A., Hoogenraad, C. C. Microtubule-based transport – basic mechanisms, traffic rules and role in neurological pathogenesis. Journal of Cellular Science. 126, 2319-2329 (2013).
  7. Gunawardena, S., Anderson, E. N., White, J. Axonal transport and neurodegenerative disease: vesicle-motor complex formation and their regulation. Degernative Neurological and Neuromuscular Disease. 4, 29-47 (2014).
  8. Rath, O., Kozielski, F. Kinesins and cancer. Nature Reviews Cancer. 12 (8), 527-539 (2012).
  9. Wang, Z. Z., et al. KIF14 promotes cell proliferation via activation of Akt and is directly targeted by miR-200c in colorectal cancer. International Journal of Oncology. 53 (5), 1939-1952 (2018).
  10. Guo, S. K., Shi, X. X., Wang, P. Y., Xie, P. Run length distribution of dimerized kinesin-3 molecular motors: comparison with dimeric kinesin-1. Scientific Reports. 9 (1), 16973 (2019).
  11. Scarabelli, G., et al. Mapping the processivity determinants of the Kinesin-3 motor domain. Biophysical Journal. 109 (8), 1537-1540 (2015).
  12. Soppina, V., et al. Dimerization of mammalian kinesin-3 motors results in superprocessive motion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 5562-5567 (2014).
  13. Soppina, V., Verhey, K. J. The family-specific K-loop influences the microtubule on-rate but not the superprocessivity of kinesin-3 motors. Molecular Biology Cell. 25 (14), 2161-2170 (2014).
  14. Soppina, V., et al. Kinesin-3 motors are fine-tuned at the molecular level to endow distinct mechanical outputs. BMC Biology. , (2022).
  15. Korten, T., Chaudhuri, S., Tavkin, E., Braun, M., Diez, S. Kinesin-1 Expressed in insect cells improves microtubule in vitro gliding performance, long-term stability and guiding efficiency in nanostructures. IEEE Transactions on Nanobioscience. 15 (1), 62-69 (2016).
  16. Schmidt, F. R. Recombinant expression systems in the pharmaceutical industry. Applied Microbiology and Biotechnology. 65 (4), 363-372 (2004).
  17. Kurland, C., Gallant, J. Errors of heterologous protein expression. Current Opinions in Biotechnology. 7 (5), 489-493 (1996).
  18. Tao, L., Scholey, J. M. Purification and assay of mitotic motors. Methods. 51 (2), 233-241 (2010).
  19. Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature Biotechnology. 23 (5), 567-575 (2005).
  20. Felberbaum, R. S. The baculovirus expression vector system: A commercial manufacturing platform for viral vaccines and gene therapy vectors. Biotechnology Journal. 10 (5), 702-714 (2015).
  21. Kumar, N., Pandey, D., Halder, A., Kumar, D., Gong, C. . Trends in Insect Molecular Biology and Biotechnology. , 163-191 (2018).
  22. Nagano, T. Development of fluorescent probes for bioimaging applications. Proceedings of the Japan Academy. Series B. Physical and Biological Sciences. 86 (8), 837-847 (2010).
  23. Hassan, M., Klaunberg, B. A. Biomedical applications of fluorescence imaging in vivo. Comparative Medicine. 54 (6), 635-644 (2004).
  24. Yang, Z., Samanta, S., Yan, W., Yu, B., Qu, J. Super-resolution microscopy for biological imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 3233, 23-43 (2021).
  25. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  26. Waters, J. C. Live-cell fluorescence imaging. Methods in Cell Biology. 114, 125-150 (2013).
  27. Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).
  28. Wojtovich, A. P., Foster, T. H. Optogenetic control of ROS production. Redox Biology. 2, 368-376 (2014).
  29. Cai, D., Verhey, K. J., Meyhofer, E. Tracking single Kinesin molecules in the cytoplasm of mammalian cells. Biophysical Journal. 92 (12), 4137-4144 (2007).
  30. Bohm, K. J., Stracke, R., Baum, M., Zieren, M., Unger, E. Effect of temperature on kinesin-driven microtubule gliding and kinesin ATPase activity. FEBS Letters. 466, 59-62 (2000).
  31. Porter, M. E., et al. Characterization of the microtubule movement produced by sea urchin egg kinesin. The Journal of Biological Chemistry. 262 (6), 2794-2802 (1987).
  32. Muyldermans, S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).
  33. Verma, S., Kumar, N., Verma, V. Role of paclitaxel on critical nucleation concentration of tubulin and its effects thereof. Biochemical and Biophysical Research Communications. 478 (3), 1350-1354 (2016).
  34. Parness, J., Horwitz, S. B. Taxol binds to polymerized tubulin in vitro. Journal of Cell Biology. 91 (2), 479-487 (1981).
  35. Schiff, P. B., Fant, J., Horwitz, S. B. Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol. Nature. 277 (5698), 665-667 (1979).
  36. Kato, T., Kageshima, A., Suzuki, F., Park, E. Y. Expression and purification of human (pro)renin receptor in insect cells using baculovirus expression system. Protein Expression and Purification. 58 (2), 242-248 (2008).
  37. Liu, F., Wu, X., Li, L., Liu, Z., Wang, Z. Use of baculovirus expression system for generation of virus-like particles: successes and challenges. Protein Expression and Purification. 90 (2), 104-116 (2013).
  38. Terpe, K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Applied Microbiology and Biotechnology. 60 (5), 523-533 (2003).
  39. Huang, S. T., et al. Liposomal paclitaxel induces fewer hematopoietic and cardiovascular complications than bioequivalent doses of Taxol. International Journal of Oncology. 53 (3), 1105-1117 (2018).

Play Video

Cite This Article
Soppina, P., Shewale, D. J., Naik, P. K., Soppina, V. Single-Molecule Analysis of Sf9 Purified Superprocessive Kinesin-3 Family Motors. J. Vis. Exp. (185), e63837, doi:10.3791/63837 (2022).

View Video