Одномолекулярный анализ очищенных сверхпроцессорных двигателей семейства кинезин-3 Sf9
Summary
В этом исследовании подробно описывается очистка KIF1A (1-393LZ), члена семейства кинезин-3, с использованием системы экспрессии Sf9-бакуловируса. Анализ одномолекулярного и многомоторного скольжения in vitro этих очищенных двигателей показал надежные свойства подвижности, сопоставимые с двигателями из лизата клеток млекопитающих. Таким образом, Sf9-бакуловирусная система поддается экспрессии и очистке интересующего моторного белка.
Abstract
Сложная клеточная среда создает проблемы для анализа подвижности одной молекулы. Тем не менее, прогресс в методах визуализации улучшил исследования одной молекулы и приобрел огромную популярность в обнаружении и понимании динамического поведения флуоресцентных помеченных молекул. Здесь мы описываем подробный метод одномолекулярных исследований in vitro двигателей семейства кинезин-3 с использованием микроскопии тотальной флуоресценции внутреннего отражения (TIRF). Кинезин-3 – это большое семейство, которое играет решающую роль в клеточных и физиологических функциях, начиная от внутриклеточного транспорта груза до деления клеток и развития. Ранее мы показали, что конститутивно активные двигатели димерного кинезина-3 демонстрируют быструю и сверхпроцессорную подвижность с высоким сродством микротрубочек на одномолекулярном уровне с использованием клеточных лизатов, полученных путем экспрессии мотора в клетках млекопитающих. Наша лаборатория изучает двигатели кинезин-3 и их регуляторные механизмы с использованием клеточного, биохимического и биофизического подходов, и такие исследования требуют очищенных белков в больших масштабах. Экспрессия и очистка этих двигателей с использованием клеток млекопитающих были бы дорогостоящими и трудоемкими, тогда как экспрессия в системе экспрессии прокариот привела бы к значительно агрегированному и неактивному белку. Чтобы преодолеть ограничения, связанные с системами бактериальной очистки и лизатом клеток млекопитающих, мы создали надежную систему экспрессии Sf9-бакуловируса для экспрессии и очистки этих двигателей. Двигатели кинезин-3 имеют С-концевую маркировку 3-тандемными флуоресцентными белками (3xmCitirine или 3xmCit), которые обеспечивают улучшенные сигналы и уменьшенное фотоотбеливание. Анализ очищенных белков Sf9 in vitro с одной молекулой и несколькими двигателями скольжения показывает, что двигатели кинезин-3 быстры и сверхпроцессорны, сродни нашим предыдущим исследованиям с использованием лизатов клеток млекопитающих. Другие приложения, использующие эти анализы, включают подробное знание олигомерных условий двигателей, конкретных партнеров связывания, параллельных биохимическим исследованиям, и их кинетического состояния.
Introduction
Чрезвычайно переполненная клеточная среда создает много проблем при сортировке предназначенных белков и молекул. Этой интенсивной нагрузке на организацию и пространственно-временное распределение молекул внутри цитоплазмы способствуют молекулярные моторы и цитоскелетные следы. Молекулярные двигатели – это ферменты, которые гидролизуют энергетические валюты, такие как АТФ, и используют эту энергию во время движения и генерации силы1. Основываясь на сходстве аминокислотных последовательностей, кинезины сгруппированы в 14 семейств, и, несмотря на это сходство, каждый двигатель вносит уникальный вклад в функционирование клетки. Двигатели семейства Kinesin-3 составляют один из крупнейших, включающий пять подсемейств (KIF1, KIF13, KIF14, KIF16 и KIF28)2, связанных с различными клеточными и физиологическими функциями, включая перенос пузырьков, сигнализацию, митоз, ядерную миграцию и развитие 3,4,5. Нарушение транспортной функции кинезин-3 связано со многими нейродегенеративными расстройствами, дефектами развития и онкологическими заболеваниями 6,7,8,9.
Недавняя работа показала, что двигатели кинезин-3 являются мономерами, но подвергаются димеризации, вызванной грузом, и приводят к быстрой и сверхпроцессорной подвижности по сравнению с обычным кинезином 10,11,12,13. Их биохимическая и биофизическая характеристика нуждается в большом количестве очищенных, активных белков. Однако их производство в системе прокариотической экспрессии приводило к неактивным или агрегированным двигателям, предположительно из-за несовместимых механизмов синтеза, сворачивания и модификации белка 14,15,16,17,18. Чтобы обойти такие ограничения и увеличить урожайность, здесь мы создали надежную систему экспрессии Sf9-бакуловируса для экспрессии и очистки этих двигателей.
Система экспрессии бакуловируса использует клеточные линии насекомых Sf9 в качестве системы-хозяина для высокопроизводительной экспрессии эукариотического рекомбинантного белка19,20. Бакуловирус обладает сильным промотором многогранника, который помогает в гетерологичной экспрессии генов и производстве растворимых рекомбинантных белков17. Благодаря своей экономической эффективности, безопасности в обращении и большому количеству активной экспрессии белка, он стал мощным инструментом21. Чтобы выразить интересующий белок, ключевым шагом является генерация рекомбинантного bacmid. Поскольку коммерчески доступные комплекты генерации bacmid стоят дорого, и мы будем работать с большим количеством образцов, мы разработали собственный протокол для больших и маленьких вставок двигателей kinesin-3 в bacmids. Sf9-очищенные кинезин-3 двигатели были использованы для характеристики свойств скольжения in vitro одномолекулярных и многомоторных микротрубочек с использованием флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (TIRF). Двигатели имеют С-концевую маркировку 3-тандемными флуоресцентными молекулами (3xmCit) для обеспечения улучшенного сигнала и снижения фотоотбеливания. Благодаря повышенному соотношению сигнал/шум, меньшей фототоксичности и селективной визуализации очень небольшой области, близкой к крышке, визуализация TIRF широко используется для визуализации динамики белка на одномолекулярном уровне in vivo и in vitro.
В этом исследовании обсуждается очистка двигателей кинезин-3 с использованием системы экспрессии Sf9-бакуловируса и визуализации in vitro с одной молекулой и многомоторного скользящего анализа двигателей с использованием микроскопии TIRF. В целом, это исследование показывает, что свойства подвижности очищенных двигателей Sf9 идентичны свойствам двигателей, полученных из лизатов клеток млекопитающих. Следовательно, мы считаем, что система Sf9-бакуловируса может быть адаптирована для экспрессии и очистки любого моторного белка, представляющего интерес.
Protocol
Representative Results
Discussion
Система экспрессии Sf9-бакуловируса является одним из наиболее универсальных и успешных методов высокопроизводительного производства белка 19,36,37. Способность к посттрансляционной модификации клеток Sf9 очень сопоставима с системой<sup c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
V.S. и P.S. благодарят профессора Кристен Дж. Верхи (Мичиганский университет, Анн-Арбор, Мичиган, США) и профессора Роопа Маллика (Индийский технологический институт Бомбея (IITB), Мумбаи, Индия) за их безусловную поддержку на протяжении всего исследования. P.S. благодарит доктора Сиваприю Кирубакаран за поддержку на протяжении всего проекта. V.S. признает финансирование через DBT (Грант No: BT/PR15214/BRB/10/1449/2015 и BT/RLF/Re-entry/45/2015) и DST-SERB (Грант No: ECR/2016/000913). P.K.N признает ICMR за финансирование (Грант No 5/13/13/2019/NCD-III). P.S. признает финансирование из DST (Грант No: SR/WOS-A/LS-73/2017). D.J.S признает стипендию от IIT Gandhinagar.
Materials
| Sf9 culture and transfection materials | |||
| anti-FLAG M2 affinity | Biolegend | 651502 | For motility purification |
| Aprotinin | Sigma | A6279 | For motility assay and purification |
| Cellfectin | Invitrogen | 10362100 | For Sf9 transfection |
| DTT | Sigma | D5545 | For motility assay mixture |
| FLAG peptide | Sigma | F3290 | For motility purification |
| Glycerol | Sigma | G5516 | For motility purification |
| HEPES | Sigma | H3375 | Preparing lysing Sf9 cells |
| IGEPAL CA 630 | Sigma | I8896 | Preparing lysing buffer for Sf9 cells |
| KCl | Sigma | P9541 | For motility purification |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | For motility assay and purification |
| MgCl2 | Sigma | M2670 | For preparing lysis buffer |
| NaCl | Sigma | S7653 | For preparing lysis buffer |
| PMSF | Sigma | P7626 | For motility purification |
| Sf9 cells | Kind gift from Dr. Thomas Pucadyil (Indian Institute of Science Education and Research, Pune, India). | For baculovirs expression and purification | |
| Sf9 culture bottles | Thermo Scientific | 4115-0125 | For suspension culture |
| Sf-900/SFM medium (1X) | Thermo Scientific | 10902-096 -500ml | For culturing Sf9 cells |
| Sucrose | Sigma | S1888 | Preparing lysing buffer for Sf9 cells |
| Unsupplemented Grace’s media | Thermo Scientific | 11595030 -500ml | For Sf9 transfection |
| Mirotubule Polymerization and Single molecule assay materails | |||
| ATP | Sigma | A2647 | For motility and gliding assay |
| BSA | Sigma | A2153 | For blocking motility chamber |
| Catalase | Sigma | C9322 | For motility and gliding assay |
| DMSO | Sigma | D5879 | For dissolving Rhodamine |
| EGTA | Sigma | 3777 | For preparing buffers |
| Glucose | Sigma | G7021 | For motility and gliding assay |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133 | For motility and gliding assay |
| GTP | Sigma | G8877 | For microtubule polymerization |
| KOH | Sigma | P1767 | Preparing PIPES buffer pH 6.9 |
| PIPES | Sigma | P6757 | For motility and gliding assay |
| Microtubule gliding assay materials | |||
| 26G needle | Dispovan | For shearing microtubules | |
| Casein | Sigma | C3400 | For microtubule glidning assay |
| GFP nanobodies | Gift from Dr. Sivaraj Sivaramakrishnan (University of Minnesota, USA) | For attaching motors to the coverslip | |
| Rhodamine | Thermo Scientific | 46406 | For preparing labelling tubulin |
| Microscope and other instruments | |||
| 0.5ml, 1.5 and 2-ml microcentrifuge tubes | Eppendorf | For Sf9 culture and purification | |
| 10ml disposable sterile pipettes | Eppendorf | For Sf9 culture and purification | |
| 10ul, 200ul, 1ml micropipette tips | Eppendorf | For Sf9 culture and purification | |
| 15ml concal tubes | Eppendorf | For Sf9 culture and purification | |
| 35mm cell culture dish | Cole Palmer | 15179-39 | For Sf9 culture |
| Balance | Sartorious | 0.01g-300g | |
| Benchtop orbial shaking incubator | REMI | For Sf9 suspenculture at 28oC | |
| Camera | EMCCD Andor iXon Ultra 897 | For TIRF imaging and acquesition | |
| Double sided tape | Scotch | For making motility chamber | |
| Glass coverslip | Fisherfinest | 12-548-5A | size; 22X30 |
| Glass slide | Blue Star | For making motility chamber | |
| Heating block | Neuation | Dissolving paraffin wax | |
| Inverted microscope | Nikon Eclipse Ti- U | To check protein expression | |
| Lasers | 488nm (100mW) | For TIRF imaging | |
| Liquid nitrogen | For sample freezing and storage | ||
| Microcapillary loading tip | Eppendorf | EP022491920 | For shearing microtubules |
| Microscope | Nikon Eclipse Ti2-E with DIC set up | For TIRF imaging | |
| Mini spin | Genetix, BiotechAsia Pvt.Ltd | For quick spin | |
| Objective | 100X TIRF objective with 1.49NA oil immersion | For TIRF imaging | |
| Optima UltraCentrifuge XE | Beckman Coulter | For protein purification | |
| Parafilm | Eppendorf | ||
| pH-meter | Corning | Coring 430 | To adjust pH |
| Pipette-boy | VWR | For Sf9 culture and purification | |
| Sorvall Legend Micro 21 | Thermo Scientific | For protein purification | |
| Sorvall ST8R centrifuge | Thermo Scientific | Protein purification | |
| ThermoMixer | Eppendorf | For microtubule polymerization | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman coulter | SW60Ti rotor | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman | 5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm | |
| Vortex mixer | Neuation | Sample mixing | |
| Wax | Sigma | V001228 | To seal motility chamber |
References
- Vale, R. D. The molecular motor toolbox for intracellular transport. Cell. 112, 467-480 (2003).
- Miki, H., Okada, Y., Hirokawa, N. Analysis of the kinesin superfamily: insights into structure and function. Trends in Cell Biology. 15 (9), 467-476 (2005).
- Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).
- Hirokawa, N., Takemura, R. Molecular motors and mechanisms of directional transport in neurons. Nature Reviews Neuroscience. 6 (3), 201-214 (2005).
- Patel, N. M., et al. KIF13A motors are regulated by Rab22A to function as weak dimers inside the cell. Scientific Advances. 7 (6), (2021).
- Franker, M. A., Hoogenraad, C. C. Microtubule-based transport – basic mechanisms, traffic rules and role in neurological pathogenesis. Journal of Cellular Science. 126, 2319-2329 (2013).
- Gunawardena, S., Anderson, E. N., White, J. Axonal transport and neurodegenerative disease: vesicle-motor complex formation and their regulation. Degernative Neurological and Neuromuscular Disease. 4, 29-47 (2014).
- Rath, O., Kozielski, F. Kinesins and cancer. Nature Reviews Cancer. 12 (8), 527-539 (2012).
- Wang, Z. Z., et al. KIF14 promotes cell proliferation via activation of Akt and is directly targeted by miR-200c in colorectal cancer. International Journal of Oncology. 53 (5), 1939-1952 (2018).
- Guo, S. K., Shi, X. X., Wang, P. Y., Xie, P. Run length distribution of dimerized kinesin-3 molecular motors: comparison with dimeric kinesin-1. Scientific Reports. 9 (1), 16973 (2019).
- Scarabelli, G., et al. Mapping the processivity determinants of the Kinesin-3 motor domain. Biophysical Journal. 109 (8), 1537-1540 (2015).
- Soppina, V., et al. Dimerization of mammalian kinesin-3 motors results in superprocessive motion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 5562-5567 (2014).
- Soppina, V., Verhey, K. J. The family-specific K-loop influences the microtubule on-rate but not the superprocessivity of kinesin-3 motors. Molecular Biology Cell. 25 (14), 2161-2170 (2014).
- Soppina, V., et al. Kinesin-3 motors are fine-tuned at the molecular level to endow distinct mechanical outputs. BMC Biology. , (2022).
- Korten, T., Chaudhuri, S., Tavkin, E., Braun, M., Diez, S. Kinesin-1 Expressed in insect cells improves microtubule in vitro gliding performance, long-term stability and guiding efficiency in nanostructures. IEEE Transactions on Nanobioscience. 15 (1), 62-69 (2016).
- Schmidt, F. R. Recombinant expression systems in the pharmaceutical industry. Applied Microbiology and Biotechnology. 65 (4), 363-372 (2004).
- Kurland, C., Gallant, J. Errors of heterologous protein expression. Current Opinions in Biotechnology. 7 (5), 489-493 (1996).
- Tao, L., Scholey, J. M. Purification and assay of mitotic motors. Methods. 51 (2), 233-241 (2010).
- Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature Biotechnology. 23 (5), 567-575 (2005).
- Felberbaum, R. S. The baculovirus expression vector system: A commercial manufacturing platform for viral vaccines and gene therapy vectors. Biotechnology Journal. 10 (5), 702-714 (2015).
- Kumar, N., Pandey, D., Halder, A., Kumar, D., Gong, C. . Trends in Insect Molecular Biology and Biotechnology. , 163-191 (2018).
- Nagano, T. Development of fluorescent probes for bioimaging applications. Proceedings of the Japan Academy. Series B. Physical and Biological Sciences. 86 (8), 837-847 (2010).
- Hassan, M., Klaunberg, B. A. Biomedical applications of fluorescence imaging in vivo. Comparative Medicine. 54 (6), 635-644 (2004).
- Yang, Z., Samanta, S., Yan, W., Yu, B., Qu, J. Super-resolution microscopy for biological imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 3233, 23-43 (2021).
- Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
- Waters, J. C. Live-cell fluorescence imaging. Methods in Cell Biology. 114, 125-150 (2013).
- Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).
- Wojtovich, A. P., Foster, T. H. Optogenetic control of ROS production. Redox Biology. 2, 368-376 (2014).
- Cai, D., Verhey, K. J., Meyhofer, E. Tracking single Kinesin molecules in the cytoplasm of mammalian cells. Biophysical Journal. 92 (12), 4137-4144 (2007).
- Bohm, K. J., Stracke, R., Baum, M., Zieren, M., Unger, E. Effect of temperature on kinesin-driven microtubule gliding and kinesin ATPase activity. FEBS Letters. 466, 59-62 (2000).
- Porter, M. E., et al. Characterization of the microtubule movement produced by sea urchin egg kinesin. The Journal of Biological Chemistry. 262 (6), 2794-2802 (1987).
- Muyldermans, S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).
- Verma, S., Kumar, N., Verma, V. Role of paclitaxel on critical nucleation concentration of tubulin and its effects thereof. Biochemical and Biophysical Research Communications. 478 (3), 1350-1354 (2016).
- Parness, J., Horwitz, S. B. Taxol binds to polymerized tubulin in vitro. Journal of Cell Biology. 91 (2), 479-487 (1981).
- Schiff, P. B., Fant, J., Horwitz, S. B. Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol. Nature. 277 (5698), 665-667 (1979).
- Kato, T., Kageshima, A., Suzuki, F., Park, E. Y. Expression and purification of human (pro)renin receptor in insect cells using baculovirus expression system. Protein Expression and Purification. 58 (2), 242-248 (2008).
- Liu, F., Wu, X., Li, L., Liu, Z., Wang, Z. Use of baculovirus expression system for generation of virus-like particles: successes and challenges. Protein Expression and Purification. 90 (2), 104-116 (2013).
- Terpe, K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Applied Microbiology and Biotechnology. 60 (5), 523-533 (2003).
- Huang, S. T., et al. Liposomal paclitaxel induces fewer hematopoietic and cardiovascular complications than bioequivalent doses of Taxol. International Journal of Oncology. 53 (3), 1105-1117 (2018).
