Sf9 정제 초공정 키네신-3 제품군 모터의 단일 분자 분석
Summary
이 연구는 Sf9-바쿨로바이러스 발현 시스템을 사용하여 키네신-3 계열의 구성원인 KIF1A(1-393LZ)의 정제에 대해 자세히 설명합니다. 이들 정제된 모터의 시험관내 단일분자 및 다중-모터 글라이딩 분석은 포유동물 세포 용해물로부터의 모터에 필적하는 강력한 운동성 특성을 나타냈다. 따라서, Sf9-바쿨로바이러스 시스템은 관심있는 운동 단백질을 발현하고 정제하는 것이 가능하다.
Abstract
복잡한 세포 환경은 단일 분자 운동성 분석에 어려움을 야기합니다. 그러나 이미징 기술의 발전으로 단일 분자 연구가 개선되었으며 형광 태그 분자의 동적 거동을 감지하고 이해하는 데 엄청난 인기를 얻었습니다. 여기에서는 TIRF(전반사 형광) 현미경을 사용하여 kinesin-3 계열 모터의 체외 단일 분자 연구에 대한 자세한 방법을 설명합니다. Kinesin-3는 세포 내 화물 수송에서 세포 분열, 발달에 이르기까지 세포 및 생리적 기능에 중요한 역할을 하는 대가족입니다. 우리는 이전에 구성 활성 이량 체 키네신 -3 모터가 포유류 세포에서 모터를 발현하여 제조 된 세포 용해물을 사용하여 단일 분자 수준에서 높은 미세 소관 친화력으로 빠르고 초 프로세스 운동성을 나타낸다는 것을 보여주었습니다. 우리 실험실은 세포, 생화학 및 생물 물리학 적 접근법을 사용하여 kinesin-3 모터와 조절 메커니즘을 연구하며, 이러한 연구는 대규모로 정제 된 단백질을 요구합니다. 포유류 세포를 사용하여 이러한 모터의 발현 및 정제는 비용이 많이 들고 시간이 많이 소요되는 반면, 원핵생물 발현 시스템에서의 발현은 상당히 응집되고 비활성 단백질을 초래했습니다. 박테리아 정제 시스템과 포유류 세포 용해물의 한계를 극복하기 위해 당사는 이러한 모터를 발현하고 정제하는 강력한 Sf9-바쿨로바이러스 발현 시스템을 구축했습니다. kinesin-3 모터는 향상된 신호를 제공하고 광퇴색을 감소시키는 3-탠덤 형광 단백질(3xmCitirine 또는 3xmCit)로 C-말단 태그가 지정되어 있습니다. Sf9 정제 단백질의 시험관 내 단일 분자 및 다중 모터 글라이딩 분석은 키네신-3 모터가 포유류 세포 용해물을 사용한 이전 연구와 유사하게 빠르고 초공정적임을 보여줍니다. 이러한 분석을 사용하는 다른 응용 분야에는 모터의 올리고머 조건, 생화학 연구를 병행하는 특정 결합 파트너 및 운동 상태에 대한 자세한 지식이 포함됩니다.
Introduction
엄청나게 붐비는 세포 환경은 예정된 단백질과 분자를 분류하는 데 많은 문제를 제기합니다. 세포질 내 분자의 조직과 시공간 분포의 이러한 강렬한 작업량은 분자 모터와 세포 골격 트랙에 의해 촉진됩니다. 분자 모터는 ATP와 같은 에너지 통화를 가수분해하고 운동 및 힘 생성중에 해당 에너지를 활용하는 효소입니다1. 아미노산 서열 유사성에 따라 키네신은 14 개의 패밀리로 그룹화되며 이러한 유사성에도 불구하고 각 모터는 세포의 기능에 고유하게 기여합니다. Kinesin-3 제품군 모터는 소포 수송, 신호 전달, 유사분열, 핵 이동 및 발달 3,4,5를 포함한 다양한 세포 및 생리적 기능과 관련된 5개의 하위 패밀리(KIF1, KIF13, KIF14, KIF16 및 KIF28)2로 구성된 가장 큰 모터 중 하나입니다. 키네신-3 수송 기능의 손상은 많은 신경퇴행성 장애, 발달 결함 및암 질환과 관련이 있습니다6,7,8,9.
최근 연구에 따르면 키네신-3 모터는 단량체이지만 화물 유도 이량체화를 거쳐 기존 키네신10,11,12,13에 비해 빠르고 초공정 운동성을 초래합니다. 그들의 생화학 적 및 생물 물리학 적 특성화에는 많은 양의 정제 된 활성 단백질이 필요합니다. 그러나, 원핵 생물 발현 시스템에서의 이들의 생산은 아마도 호환되지 않는 단백질 합성, 접힘 및 변형 기계 14,15,16,17,18로 인해 비활성 또는 응집 된 모터를 초래했다. 이러한 한계를 우회하고 수율을 높이기 위해 여기에서 우리는 이러한 모터를 발현하고 정제하는 강력한 Sf9-baculovirus 발현 시스템을 구축했습니다.
바쿨로바이러스 발현 시스템은 Sf9 곤충 세포주를 고처리량 진핵생물 재조합 단백질 발현19,20을 위한 숙주 시스템으로 사용합니다. Baculovirus는 이종 유전자 발현 및 가용성 재조합 단백질17의 생산을 돕는 강력한 다면체 프로모터를 보유한다. 비용 효율성, 취급 안전성 및 다량의 활성 단백질 발현으로 인해 강력한 도구21이되었습니다. 관심있는 단백질을 발현하기 위해, 핵심 단계는 재조합 bacmid를 생성하는 것이다. 상업적으로 이용 가능한 bacmid 생성 키트는 비싸고 더 많은 샘플로 작업 할 것이기 때문에 우리는 bacmids에 kinesin-3 모터의 크고 작은 삽입물 모두를위한 사내 프로토콜을 개발했습니다. Sf9-정제된 키네신-3 모터는 전반사 형광(TIRF) 현미경을 사용하여 시험관 내 단일 분자 및 다중 모터 미세소관 글라이딩 특성을 특성화하는 데 사용되었습니다. 모터는 향상된 신호를 제공하고 광퇴색을 줄이기 위해 3-직렬 형광 분자(3xmCit)로 C 단자 태그가 지정됩니다. TIRF 이미징은 증가 된 신호 대 잡음비, 적은 광독성 및 커버 슬립에 가까운 매우 작은 영역의 선택적 이미징으로 인해 생체 내 및 시험관 내에서 단일 분자 수준에서 단백질 역학을 시각화하는 데 널리 사용되었습니다.
이 연구는 Sf9-바쿨로바이러스 발현 시스템과 TIRF 현미경을 사용한 모터의 체외 단일 분자 이미징 및 다중 모터 글라이딩 분석을 사용하여 키네신-3 모터의 정제에 대해 논의합니다. 전체적으로, 이 연구는 Sf9 정제된 모터의 운동성 특성이 포유류 세포 용해물로부터 제조된 모터의 그것과 동일하다는 것을 보여준다. 따라서 우리는 Sf9-baculovirus 시스템이 관심있는 모든 운동 단백질을 발현하고 정제하도록 적응할 수 있다고 믿습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sf9-바쿨로바이러스 발현 시스템은 고처리량 단백질 생산을 위한 가장 다재다능하고 성공적인 방법 중 하나입니다 19,36,37. Sf9 세포의 번역후 변형 능력은 포유동물 시스템(15)과 매우 유사하다. 이 시스템을 사용할 때의 상당한 단점은 느리고 오염에 민감하다는 것입니다. 가장 중요한 단계 중 하나는 Sf9 세포?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
V.S.와 P.S. Kristen J. Verhey 교수 (미시간 대학교, 앤아버, 미시건, 미국)와 Roop Mallik 교수 (인도 뭄바이의 인도 봄베이 공과 대학 (IITB))에게 연구 전반에 걸친 무조건적인 지원에 감사드립니다. 추신 : 프로젝트 전반에 걸쳐 그녀의 지원에 대해 Sivapriya Kirubakaran 박사에게 감사드립니다. VS는 DBT(보조금 번호: BT/PR15214/BRB/10/1449/2015 및 BT/RLF/재진입/45/2015) 및 DST-SERB(보조금 번호: ECR/2016/000913)를 통한 자금 지원을 인정합니다. PKN은 자금 조달을 위해 ICMR을 인정합니다 (보조금 번호 5 / 13 / 13 / 2019 / NCD-III). 추신 : DST (보조금 번호 : SR / WOS-A / LS-73 / 2017)의 자금 지원을 인정합니다. DJS는 IIT Gandhinagar의 친목을 인정합니다.
Materials
| Sf9 culture and transfection materials | |||
| anti-FLAG M2 affinity | Biolegend | 651502 | For motility purification |
| Aprotinin | Sigma | A6279 | For motility assay and purification |
| Cellfectin | Invitrogen | 10362100 | For Sf9 transfection |
| DTT | Sigma | D5545 | For motility assay mixture |
| FLAG peptide | Sigma | F3290 | For motility purification |
| Glycerol | Sigma | G5516 | For motility purification |
| HEPES | Sigma | H3375 | Preparing lysing Sf9 cells |
| IGEPAL CA 630 | Sigma | I8896 | Preparing lysing buffer for Sf9 cells |
| KCl | Sigma | P9541 | For motility purification |
| Leupeptin | Sigma | L2884 | For motility assay and purification |
| MgCl2 | Sigma | M2670 | For preparing lysis buffer |
| NaCl | Sigma | S7653 | For preparing lysis buffer |
| PMSF | Sigma | P7626 | For motility purification |
| Sf9 cells | Kind gift from Dr. Thomas Pucadyil (Indian Institute of Science Education and Research, Pune, India). | For baculovirs expression and purification | |
| Sf9 culture bottles | Thermo Scientific | 4115-0125 | For suspension culture |
| Sf-900/SFM medium (1X) | Thermo Scientific | 10902-096 -500ml | For culturing Sf9 cells |
| Sucrose | Sigma | S1888 | Preparing lysing buffer for Sf9 cells |
| Unsupplemented Grace’s media | Thermo Scientific | 11595030 -500ml | For Sf9 transfection |
| Mirotubule Polymerization and Single molecule assay materails | |||
| ATP | Sigma | A2647 | For motility and gliding assay |
| BSA | Sigma | A2153 | For blocking motility chamber |
| Catalase | Sigma | C9322 | For motility and gliding assay |
| DMSO | Sigma | D5879 | For dissolving Rhodamine |
| EGTA | Sigma | 3777 | For preparing buffers |
| Glucose | Sigma | G7021 | For motility and gliding assay |
| Glucose oxidase | Sigma | G2133 | For motility and gliding assay |
| GTP | Sigma | G8877 | For microtubule polymerization |
| KOH | Sigma | P1767 | Preparing PIPES buffer pH 6.9 |
| PIPES | Sigma | P6757 | For motility and gliding assay |
| Microtubule gliding assay materials | |||
| 26G needle | Dispovan | For shearing microtubules | |
| Casein | Sigma | C3400 | For microtubule glidning assay |
| GFP nanobodies | Gift from Dr. Sivaraj Sivaramakrishnan (University of Minnesota, USA) | For attaching motors to the coverslip | |
| Rhodamine | Thermo Scientific | 46406 | For preparing labelling tubulin |
| Microscope and other instruments | |||
| 0.5ml, 1.5 and 2-ml microcentrifuge tubes | Eppendorf | For Sf9 culture and purification | |
| 10ml disposable sterile pipettes | Eppendorf | For Sf9 culture and purification | |
| 10ul, 200ul, 1ml micropipette tips | Eppendorf | For Sf9 culture and purification | |
| 15ml concal tubes | Eppendorf | For Sf9 culture and purification | |
| 35mm cell culture dish | Cole Palmer | 15179-39 | For Sf9 culture |
| Balance | Sartorious | 0.01g-300g | |
| Benchtop orbial shaking incubator | REMI | For Sf9 suspenculture at 28oC | |
| Camera | EMCCD Andor iXon Ultra 897 | For TIRF imaging and acquesition | |
| Double sided tape | Scotch | For making motility chamber | |
| Glass coverslip | Fisherfinest | 12-548-5A | size; 22X30 |
| Glass slide | Blue Star | For making motility chamber | |
| Heating block | Neuation | Dissolving paraffin wax | |
| Inverted microscope | Nikon Eclipse Ti- U | To check protein expression | |
| Lasers | 488nm (100mW) | For TIRF imaging | |
| Liquid nitrogen | For sample freezing and storage | ||
| Microcapillary loading tip | Eppendorf | EP022491920 | For shearing microtubules |
| Microscope | Nikon Eclipse Ti2-E with DIC set up | For TIRF imaging | |
| Mini spin | Genetix, BiotechAsia Pvt.Ltd | For quick spin | |
| Objective | 100X TIRF objective with 1.49NA oil immersion | For TIRF imaging | |
| Optima UltraCentrifuge XE | Beckman Coulter | For protein purification | |
| Parafilm | Eppendorf | ||
| pH-meter | Corning | Coring 430 | To adjust pH |
| Pipette-boy | VWR | For Sf9 culture and purification | |
| Sorvall Legend Micro 21 | Thermo Scientific | For protein purification | |
| Sorvall ST8R centrifuge | Thermo Scientific | Protein purification | |
| ThermoMixer | Eppendorf | For microtubule polymerization | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman coulter | SW60Ti rotor | |
| Ultracentrifuge tubes | Beckman | 5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm | |
| Vortex mixer | Neuation | Sample mixing | |
| Wax | Sigma | V001228 | To seal motility chamber |
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