מיקרוסקופיית אלקטרונים המושרה על ידי אור באתרו לתצפית על אינטראקציית החומר הנוזלי-רך
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר שינויים במיקרוסקופ אלקטרונים (TEM) עם מערכת תאורת אור, ייצור תאים נוזליים, ותצפיות in situ TEM של אינטראקציות הנגרמות על ידי אור בין תאי חיידקים לבין פוטוסנסיטייזר. כמו כן נדונו שיטות הכנת הדגימה, נזק לקרן אלקטרונים והדמיה.
Abstract
הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השינויים במערך מיקרוסקופ האלקטרונים (TEM) עבור תצפיות הנגרמות על ידי אור באתרו . סיב אופטי מזכוכית שהוכנס לעמוד האלקטרונים מעל קוטב העדשה האובייקטיבית, ולייזר, מקור אור מתכוונן, שימש לייצור המכשיר. לאחר שהתאורה כוילה באמצעות מערכת מדידה חיצונית, היא מאפשרת להתאים את עוצמת התאורה לצרכי התהליך הנצפה. מערכת תאורה זו נוצלה כדי לדמות תופעות של טיפול פוטודינמי אנטי-מיקרוביאלי, שהן כיום נושא למחקר אינטנסיבי. הדגימה הוכנה על ידי איתור תרחיף של חיידקים על מצע פחמן, גרפן או סיליקון ניטריד, הכתמת התמיסה העודפת, איתור תמיסת הפוטוסנסיטייזר, הכתמת הנוזל העודף, ולאחר מכן הרכבת התא הנוזלי עם מצע שני או סרט גרפן. תהליך ניסוי ההדמיה עצמו כולל בחירת המקום הנכון לתצפית תוך שימוש בהגדלה נמוכה ומינון מינימלי של אלקטרונים, ולאחר מכן הפעלה מחזורית של מקור האור כדי ללכוד תמונות עוקבות במרווחים מוגדרים עם כמות האלקטרונים המינימלית הדרושה. מינון האלקטרונים של כל חשיפה וזמן ועוצמת התאורה המשמשים צריכים להיות מתועדים בקפידה בשל המורכבות של התופעות הנצפות, שכן יחד עם זאת, התהליך הוא גם מונחה אור וגם אלקטרונים. לאחר ביצוע הניסוי בפועל, יש לבצע תצפיות בקרה נוספות, שבהן נעשה שימוש במינונים זהים של אלקטרונים אך ללא השפעת אור נוספת ומינונים קטנים יותר של אלקטרונים משמשים למינונים גבוהים יותר של אור. זה מאפשר להבחין בין השפעות מיקרו-סטרוקטורליות הנגרמות על ידי אור לבין אלה הנגרמות על ידי אלקטרונים הן בתחומי החיים והן בתחומי מדע החומרים.
Introduction
תופעות הנגרמות על ידי אור ברזולוציה גבוהה מעניינות בתחומים רבים כגון ננו-הנדסה 1,2,3, קטליזה 4,5 וביו-פוטוניקה6. כמה עיצובים מקוריים המאפשרים ניסויים כאלה ניתן למצוא בספרות, כולל שינויים של מחזיקי המדגם 1,4,7,8,9 והסיבים האופטיים המחוברים למיקרוסקופ 10,11.
השילוב של תאורת אור, סביבה נוזלית ומיקרוסקופיית אלקטרונים (TEM) מעניק הזדמנות מצוינת למחקרים דינמיים מפורטים של תהליכים המושרים על ידי פוטו. עם זאת, מצב הוואקום הגבוה בתוך המיקרוסקופ הוא שלילי למדי עבור נוזלים רבים, במיוחד פתרונות מים. אנקפסולציה נוזלית, המגנה עליו מפני הסביבה, יכולה להיות מושגת באמצעות כמה טכניקות המבוססות בעיקר על גרפן12, סיליקון ניטריד 13, או מצעי פחמן14. בנוסף למחקר במדע החומרים2, מה שמכונה תאים נוזליים מציעים אפשרויות לביצוע תצפיות מיקרוסקופיות לא קונבנציונליות על דגימות ביולוגיות בקרבת התנאים הטבעיים שלהם15. תצפיות כאלה הן תובעניות ביותר, במיוחד עבור מיקרואורגניזמים חיים כגון תאי חיידקים. קרן האלקטרונים כקרינה מייננת גורמת נזק בלתי הפיך לדגימות הלחות, ולכן יש לציין את מינון האלקטרונים16. זה הכרחי כדי למזער השפעות שליליות, לשלוט על הנזק, ולמנוע ממצאים מבלבלים. מינון האלקטרונים המרבי האופטימלי המאפשר תצפיות על תאים חיים הוא עדיין נושא מפוקפק16, אך נראה כי המינון של 30 e−/nm2 הוא ערך הסף, לפחות עבור חיידקים17.
חלק מהנושאים שמעניינים מחקרים מיקרוסקופיים כאלה הם תהליכים במהלך טיפול פוטודינמי אנטי-מיקרוביאלי (APDT)18. בקיצור, הטיפול ממשיך כדלקמן. תאי החיידקים מוקפים בנוזל רגיש לאור הנקרא פוטוסנסיטייזר. כאשר תאורת אור ניתנת באורך גל מסוים, מיני החמצן הריאקטיבי הציטוטוקסי (ROS) נוצרים מהעברת אנרגיה או מטען ממולקולות הפוטוסנסיטייזר המעוררות אל החמצן שנמצא באופן טבעי בתמיסה. פתוגנים שנחשפו ל- ROS מושתקים במהירות ביעילות גבוהה מאוד, ללא תופעות לוואי19. התגובה לטיפול משתנה עבור מיקרובים שונים – לדוגמה, ההשפעה של אותו פוטוסנסיטייזר עשויה להיות שונה לגמרי עבור חיידקים גראם חיוביים וגראם שליליים20. באופן כללי, נקבע כי המטרה העיקרית של ROS היא המבנים החיצוניים של התאים, שם נזק גורם להפרעות תפקודיות של קרום התא, וכתוצאה מכך, להוביל למוות של חיידקים21,22. עם זאת, נזק חומצות גרעין וחלבוניםיכול גם להיחשב גורם של השבתה18, ולכן עדיין לא ידוע אילו מבנים התא הם המטרות העיקריות במהלך תהליך זה19. הבנה מעמיקה יותר של התהליכים המזיקים עשויה לסייע בשיפור הטיפול הסופי הזה. בהשוואה לשיטות מיקרוסקופיית האור המשמשות במחקר APDT23, טכניקות TEM נותנות אפשרויות רבות יותר להסתכל על מנגנון APDT עם רזולוציה והגדלהגבוהות יותר 24. TEM כבר שימש בהצלחה לתצפית תאים במהלך טיפול מתמשך, מה שאיפשר לנו לחקור חיידקים גראם-חיוביים ולתאר את השינויים המתרחשים בתוך דופן התא בפירוט 6,25.
הפרוטוקול הנוכחי מציג מערך ניסויי מתאים להדמיה ברזולוציה גבוהה של השבתת חיידקים הנגרמים על ידי אור באמצעות TEM, הדורשת מערכת תאורת אור תקינה, עטיפת תאים עם נוזל ובקרת מינון אלקטרונים קפדנית. החיידק ששימש לתצפית היה סטפילוקוקוס אאורוס, ותמיסת מתילן כחולה שימשה כפוטוסנסיטייזר. מערך תאורת האור המיוחד כולל לייזר מוליך למחצה הניתן לכוונון המחובר ישירות לעמוד המיקרוסקופ באמצעות סיבי האור. תכנון זה מספק הקרנה אחידה לאורך כל הדגימה בגלל המיקום הכמעט מקביל של הסיב האופטי לציר המיקרוסקופ. אור מונוכרומטי בעוצמה גבוהה שנוצר על ידי הלייזר יכול לשמש לאחר מכן כדי לחקור השפעות פוטוכימיות שונות. לאור ששימש בניסוי היה אורך גל השווה ל-660 ננומטר מכיוון שבאזור הנראה, למתילן כחול יש שיאי בליעה ב-613 ננומטר ו-664 ננומטר26. הפרוטוקול לאנקפסולציה נוזלית מבוסס על מצעי פחמן, מה שהופך את ההליך למהיר ולא מסובך. לבסוף, מוצגת שיטה לתצפית במינון נמוך באתרה TEM של תאים בנוזל . נדונים הקשיים לגבי הכנת הדגימה, השפעות מינון האלקטרונים על הדגימה הרגישה ופענוח תמונה סביר.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההתקנה וההפעלה של התאורה דורשות ידע בסיסי בשירות ועלולות לפגוע במיקרוסקופ. הדרך הפשוטה ביותר להכניס את האור למיקרוסקופ היא לחבר את הסיב האופטי מהחלק העליון של העדשה האובייקטיבית, שם בדרך כלל יש מקום לסלילי ההטיה של TEM ולגלאים נוספים. ניתן לצפות ליותר מקום פנוי גם ממכשירי כניסה עליונים ישנ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקר נתמך על ידי מענק Miniatura (2019/03/X/NZ3/02100, המרכז הלאומי למדע, פולין).
Materials
| Carbon film on 200 mesh copper grid | Agar Scientific | AGS160 | The standard TEM grids for observations and liquid cell preparation |
| Crossover Tweezers | Dumont | N5 | The tweezers are neecesarry for liquid cell preparation |
| Photodiode Power Sensor | ThorLabs | S130C | The sensor used for light intensity measurement |
| Polyimide-Coated Multimode Fiber | Thorlabs | FG400UEP | Must be built into the microscope using the on-site built adapter, according to the 10.1016/j.ultramic.2021.113388 |
| Transmission Electron Microscope | Hitachi | H-800 | Can be replaced with any side-entry microscope, available for modification |
| Tuneable Diode Laser | CNI | MRL-III-660D | The light wavelength must be chosen basing on photosensitizer's absorption spectrum |
References
- Vadai, M., Angell, D. K., Hayee, F., Sytwu, K., Dionne, J. A. In-situ observation of plasmon-controlled photocatalytic dehydrogenation of individual palladium nanoparticles. Nature Communications. 9 (1), 1-8 (2018).
- Weng, B., et al. Visualizing light-induced dynamic structural transformations of Au clusters-based photocatalyst via in situ TEM. Nano Research. 12 (1), 1-5 (2021).
- Cao, K., et al. In situ TEM investigation on ultrafast reversible lithiation and delithiation cycling of Sn@C yolk-shell nanoparticles as anodes for lithium ion batteries. Nano Energy. 40, 187-194 (2017).
- Cavalca, F., et al. In situ transmission electron microscopy of light-induced photocatalytic reactions. Nanotechnology. 23 (7), 075705 (2012).
- Tung, C. -. W., et al. Light-induced activation of adaptive junction for efficient solar-driven oxygen evolution: In situ unraveling the interfacial metal-silicon junction. Advanced Energy Materials. 9 (31), 1901308 (2019).
- Żak, A. M., Kaczmarczyk, O., Piksa, M., Matczyszyn, K. Light-induced in situ transmission electron microscopy: Novel approach for antimicrobial photodynamic therapy imaging. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 35, 102463 (2021).
- Shindo, D., et al. Development of a multifunctional TEM specimen holder equipped with a piezodriving probe and a laser irradiation port. Journal of Electron Microscopy. 58 (4), 245-249 (2009).
- Zhang, C., et al. Photosensing performance of branched CdS/ZnO heterostructures as revealed by in situ TEM and photodetector tests. Nanoscale. 6 (14), 8084-8090 (2014).
- Zhang, C., et al. Statistically analyzed photoresponse of elastically bent CdS nanowires probed by light-compatible in situ high-resolution TEM. Nano Letters. 16 (10), 6008-6013 (2016).
- Yoshida, K., Yamasaki, J., Tanaka, N. In situ high-resolution transmission electron microscopy observation of photodecomposition process of poly-hydrocarbons on catalytic TiO2 films. Applied Physics Letters. 84 (14), 2542-2544 (2004).
- Yoshida, K., Nozaki, T., Hirayama, T., Tanaka, N. In situ high-resolution transmission electron microscopy of photocatalytic reactions by excited electrons in ionic liquid. Journal of Electron Microscopy. 56 (5), 177-180 (2007).
- Textor, M., De Jonge, N. Strategies for preparing graphene liquid cells for transmission electron microscopy. Nano Letters. 18 (6), 3313-3321 (2018).
- Ring, E. A., De Jonge, N. Microfluidic system for transmission electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 16 (5), 622-629 (2010).
- Inayoshi, Y., Minoda, H. A carbon sandwich environmental cell for wet specimens. Journal of Electron Microscopy. 62 (6), 623-628 (2013).
- Koo, K., Dae, K. S., Hahn, Y. K., Yuk, J. M. Live cell electron microscopy using graphene veils. Nano Letters. 20 (6), 4708-4713 (2020).
- De Jonge, N., Peckys, D. B. Live cell electron microscopy is probably impossible. ACS Nano. 10 (10), 9061-9063 (2016).
- Kennedy, E., Nelson, E. M., Damiano, J., Timp, G. Gene expression in electron-beam-irradiated bacteria in reply to "live cell electron microscopy is probably impossible.". ACS Nano. 11 (1), 3-7 (2017).
- Alves, E., et al. An insight on bacterial cellular targets of photodynamic inactivation. Future Medicinal Chemistry. 6 (2), 141-164 (2014).
- Cieplik, F., et al. Antimicrobial photodynamic therapy-What we know and what we don’t. Critical Reviews in Microbiology. 44 (5), 571-589 (2018).
- Huang, L., et al. Type I and Type II mechanisms of antimicrobial photodynamic therapy: An in vitro study on gram-negative and gram-positive bacteria. Lasers in Surgery and Medicine. 44 (6), 490-499 (2012).
- Caminos, D. A., Spesia, M. B., Pons, P., Durantini, E. N. Mechanisms of Escherichia coli photodynamic inactivation by an amphiphilic tricationic porphyrin and 5,10,15,20-tetra(4-N,N,N-trimethylammoniumphenyl) porphyrin. Photochemical and Photobiological Sciences. 7 (9), 1071-1078 (2008).
- Chu, J. C. H., Chin, M. L., Wong, C. T. T., Hui, M., Lo, P. C., Ng, D. K. P. One-pot synthesis of a cyclic antimicrobial peptide-conjugated phthalocyanine for synergistic chemo-photodynamic killing of multidrug-resistant bacteria. Advanced Therapeutics. 4 (3), 1-10 (2021).
- Rogers, S., Honma, K., Mang, T. S. Confocal fluorescence imaging to evaluate the effect of antimicrobial photodynamic therapy depth on P. gingivalis and T. denticola biofilms. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 23, 18-24 (2018).
- Maldonado-Carmona, N., et al. Porphyrin-loaded lignin nanoparticles against bacteria: A photodynamic antimicrobial chemotherapy application. Frontiers in Microbiology. 11, 606185 (2020).
- Żak, A. M., Kaczmarczyk, O., Piksa, M., Grzęda, J., Matczyszyn, K. Fiber-optic sample illuminator design for the observation of light induced phenomena with transmission electron microscopy in situ: Antimicrobial photodynamic therapy. Ultramicroscopy. 230, 113388 (2021).
- Dinh, V. P., et al. Insight into the adsorption mechanisms of methylene blue and chromium(III) from aqueous solution onto pomelo fruit peel. RSC Advances. 9 (44), 25847-25860 (2019).
- Żak, A. Guide to controlling the electron dose to improve low-dose imaging of sensitive samples. Micron. 145, 103058 (2021).
- Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallographica Section D. 74 (6), 560-571 (2018).
- Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. Variations on negative stain electron microscopy methods: Tools for tackling challenging systems. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
- Booth, D. S., Avila-Sakar, A., Cheng, Y. Visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain EM: From grid preparation to image acquisition. Journal of Visualized Experiments. (58), (2011).
- Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized negative staining: A high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (90), e51087 (2014).
- Miller, B. K., Crozier, P. A. System for in situ UV-visible illumination of environmental transmission electron microscopy samples. Microscopy and Microanalysis. 19 (2), 461-469 (2013).
- Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336 (6077), 61-64 (2012).
- Schneider, N. M., et al. Electron-Water interactions and implications for liquid cell electron microscopy. Journal of Physical Chemistry C. 118 (38), 22373-22382 (2014).
