Microscopia elettronica a trasmissione in situ indotta dalla luce per l'osservazione dell'interazione liquido-materia molle

I fenomeni indotti dalla luce in alta risoluzione sono interessanti in molti campi come la nanoingegneria 1,2,3, la catalisi ^4,5 e la biofotonica ⁶. Alcuni disegni originali che consentono tali esperimenti possono essere trovati in letteratura, comprese le modifiche dei supporti del campione 1,4,7,8,9 e la fibra ottica attaccata al microscopio ^10,11.

La combinazione di illuminazione luminosa, ambiente liquido e microscopia elettronica a trasmissione (TEM) offre una grande opportunità per studi dettagliati e dinamici dei processi fotoindotti. Tuttavia, la condizione di alto vuoto all’interno del microscopio è piuttosto sfavorevole per molti liquidi, in particolare le soluzioni acquose. L’incapsulamento liquido, che lo protegge dall’ambiente, può essere ottenuto utilizzando alcune tecniche basate principalmente su substrati di grafene 12, nitruro di silicio¹³ o carbonio¹⁴. Oltre alla ricerca nella scienza dei materiali², le cosiddette cellule liquide offrono la possibilità di condurre osservazioni microscopiche non convenzionali su campioni biologici vicini alle loro condizioni native¹⁵. Tali osservazioni sono estremamente impegnative, specialmente per i microrganismi viventi come le cellule batteriche. Il fascio di elettroni come radiazione ionizzante provoca danni irreversibili ai campioni idratati, quindi la dose di elettroni deve essere specificata¹⁶. Ciò è necessario per ridurre al minimo gli effetti sfavorevoli, controllare il danno ed evitare artefatti confusi. La dose massima ottimale di elettroni che consente l’osservazione delle cellule viventi è ancora un argomento discutibile¹⁶, ma la dose di 30 e⁻/nm² sembra essere il valore soglia, almeno per i batteri¹⁷.

Alcuni dei soggetti di interesse per tali studi microscopici sono i processi durante la terapia fotodinamica antimicrobica (APDT)¹⁸. In breve, la terapia procede come segue. Le cellule batteriche sono circondate dal liquido fotosensibile chiamato fotosensibilizzatore. Quando l’illuminazione della luce viene fornita a una lunghezza d’onda specifica, le specie citotossiche reattive dell’ossigeno (ROS) vengono generate dal trasferimento di energia o carica dalle molecole fotosensibilizzatrici eccitate all’ossigeno naturalmente presente nella soluzione. Gli agenti patogeni esposti ai ROS vengono rapidamente inattivati con un’efficienza molto elevata, senza effetti collaterali¹⁹. La risposta alla terapia varia per microbi distinti – ad esempio, l’impatto dello stesso fotosensibilizzatore può essere molto diverso per i batteri Gram-positivi e Gram-negativi²⁰. In generale, è stato stabilito che il bersaglio principale dei ROS sono le strutture esterne delle cellule, dove il danno provoca disturbi funzionali della membrana cellulare e, di conseguenza, porta alla morte dei batteri^21,22. Tuttavia, anche il danno agli acidi nucleici e alle proteine può essere considerato una causa di inattivazione¹⁸, quindi non è ancora noto quali strutture cellulari siano i principali bersagli durante questo processo¹⁹. Una comprensione più profonda dei processi dannosi potrebbe aiutare a migliorare questa terapia definitiva. Rispetto ai metodi di microscopia ottica utilizzati nella ricerca APDT²³, le tecniche TEM offrono maggiori possibilità di osservare il meccanismo APDT con risoluzione e ingrandimento più elevati²⁴. TEM è già stato utilizzato con successo per l’osservazione cellulare durante la terapia in corso, che ci ha permesso di studiare il danno batterico Gram-positivo e descrivere i cambiamenti che si verificano all’interno della parete cellulare in dettaglio ^6,25.

L’attuale protocollo presenta una configurazione sperimentale adatta per l’imaging ad alta risoluzione dell’inattivazione batterica indotta dalla luce utilizzando TEM, che richiede un adeguato sistema di illuminazione della luce, l’incapsulamento delle cellule con un liquido e un rigoroso controllo della dose di elettroni. Il batterio utilizzato per l’osservazione era Staphylococcus aureus e una soluzione di blu di metilene è stata utilizzata come fotosensibilizzante. La speciale configurazione di illuminazione della luce comprende un laser a semiconduttore sintonizzabile collegato direttamente alla colonna del microscopio utilizzando la fibra luminosa. Questo design fornisce un’irradiazione uniforme in tutto il campione a causa del posizionamento quasi parallelo della fibra ottica all’asse del microscopio. La luce monocromatica di alta intensità generata dal laser può quindi essere utilizzata per studiare vari effetti fotochimici. La luce utilizzata nell’esperimento aveva una lunghezza d’onda pari a 660 nm perché, nella regione visibile, il blu di metilene ha picchi di assorbimento a 613 nm e 664 nm²⁶. Il protocollo per l’incapsulamento liquido si basa su substrati di carbonio, il che rende la procedura rapida e senza complicazioni. Infine, viene presentato un metodo per l’osservazione TEM in situ a basse dosi di cellule in liquido. Vengono discusse le difficoltà relative alla preparazione del campione, agli effetti della dose di elettroni sul campione sensibile e alla ragionevole interpretazione delle immagini.