Lichtinduzierte In situ Transmissionselektronenmikroskopie zur Beobachtung der Wechselwirkung zwischen flüssiger und weicher Materie

Lichtinduzierte Phänomene in hoher Auflösung sind in vielen Bereichen wie Nanoengineering 1,2,3, Katalyse ^4,5 und Biophotonik⁶ interessant. Einige originelle Designs, die solche Experimente ermöglichen, finden sich in der Literatur, einschließlich Modifikationen der Probenhalter 1,4,7,8,9 und der am Mikroskop ^10,11 befestigten optischen Faser.

Die Kombination aus Lichtbeleuchtung, flüssiger Umgebung und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) bietet eine großartige Gelegenheit für detaillierte, dynamische Untersuchungen photoinduzierter Prozesse. Die Hochvakuumbedingungen im Mikroskop sind jedoch für viele Flüssigkeiten, insbesondere Wasserlösungen, eher ungünstig. Die Flüssigkeitsverkapselung, die es vor der Umwelt schützt, kann mit einigen Techniken erreicht werden, die hauptsächlich auf Graphen 12, Siliziumnitrid¹³ oder Kohlenstoff^{14-Substraten} basieren. Neben der materialwissenschaftlichen Forschung² bieten sogenannte flüssige Zellen Möglichkeiten, unkonventionelle mikroskopische Beobachtungen an biologischen Proben in der Nähe ihrer nativen Bedingungen^{durchzuführen 15}. Solche Beobachtungen sind vor allem für lebende Mikroorganismen wie Bakterienzellen äußerst anspruchsvoll. Der Elektronenstrahl als ionisierende Strahlung verursacht irreversible Schäden an den hydratisierten Proben, so dass die Elektronendosis angegeben werden muss¹⁶. Dies ist notwendig, um ungünstige Auswirkungen zu minimieren, den Schaden zu kontrollieren und verwirrende Artefakte zu vermeiden. Die optimale maximale Elektronendosis, die Beobachtungen lebender Zellen erlaubt, ist noch ein fragwürdiges Thema¹⁶, aber die Dosis von 30 e⁻/^nm2 scheint der Schwellenwert zu sein, zumindest für Bakterien¹⁷.

Einige der Themen, die für solche mikroskopischen Studien von Interesse sind, sind Prozesse während der antimikrobiellen photodynamischen Therapie (APDT)¹⁸. Kurz gesagt, die Therapie verläuft wie folgt. Die Bakterienzellen sind von der lichtempfindlichen Flüssigkeit namens Photosensibilisator umgeben. Wenn die Lichtbeleuchtung bei einer bestimmten Wellenlänge gegeben wird, werden die zytotoxischen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) durch Energie- oder Ladungstransfer von den angeregten Photosensibilisatormolekülen auf den natürlich in der Lösung vorhandenen Sauerstoff erzeugt. Krankheitserreger, die ROS ausgesetzt sind, werden schnell mit sehr hoher Effizienz inaktiviert, ohne Nebenwirkungen¹⁹. Das Ansprechen auf die Therapie variiert für verschiedene Mikroben – zum Beispiel kann die Wirkung desselben Photosensibilisators für grampositive und gramnegative Bakterien sehr unterschiedlich sein²⁰. Im Allgemeinen wurde festgestellt, dass das Hauptziel von ROS die äußeren Strukturen von Zellen sind, wo Schäden zu Funktionsstörungen der Zellmembran und folglich zum Tod von Bakterien führen^21,22. Aber auch Schäden an Nukleinsäuren und Proteinen können als Ursache für die Inaktivierung angesehen werden¹⁸, so dass noch unbekannt ist, welche Zellstrukturen die Hauptziele während dieses Prozesses sind¹⁹. Ein tieferes Verständnis der schädigenden Prozesse könnte helfen, diese definitive Therapie zu verbessern. Im Vergleich zu den lichtmikroskopischen Methoden, die in der APDT-Forschung²³ verwendet werden, bieten TEM-Techniken mehr Möglichkeiten, den APDT-Mechanismus mit höherer Auflösung und Vergrößerung zu betrachten²⁴. TEM wurde bereits erfolgreich zur Zellbeobachtung während der laufenden Therapie eingesetzt, wodurch wir grampositive Bakterienschäden untersuchen und die Veränderungen innerhalb der Zellwand detailliert beschreiben^{konnten 6,25}.

Das aktuelle Protokoll stellt einen geeigneten Versuchsaufbau für die hochauflösende Bildgebung der lichtinduzierten Bakterieninaktivierung mittels TEM dar, was ein geeignetes Lichtbeleuchtungssystem, die Verkapselung von Zellen mit einer Flüssigkeit und eine strenge Elektronendosiskontrolle erfordert. Das für die Beobachtung verwendete Bakterium war Staphylococcus aureus, und eine Methylenblaulösung wurde als Photosensibilisator verwendet. Der spezielle Lichtbeleuchtungsaufbau besteht aus einem durchstimmbaren Halbleiterlaser, der über die Lichtfaser direkt mit der Mikroskopsäule verbunden ist. Dieses Design bietet eine gleichmäßige Bestrahlung in der gesamten Probe aufgrund der nahezu parallelen Platzierung der optischen Faser zur Mikroskopachse. Monochromatisches Licht von hoher Intensität, das vom Laser erzeugt wird, kann dann verwendet werden, um verschiedene photochemische Effekte zu untersuchen. Das im Experiment verwendete Licht hatte eine Wellenlänge gleich 660 nm, da Methylenblau im sichtbaren Bereich Absorptionspeaks bei 613 nm und 664 nm²⁶ aufweist. Das Protokoll für die Flüssigkeitsverkapselung basiert auf Kohlenstoffsubstraten, was das Verfahren schnell und unkompliziert macht. Schließlich wird eine Methode zur niedrig dosierten in situ TEM-Beobachtung von Zellen in Flüssigkeit vorgestellt. Die Schwierigkeiten bei der Probenvorbereitung, die Auswirkungen der Elektronendosis auf die empfindliche Probe und die vernünftige Bildinterpretation werden diskutiert.