Microscopía electrónica de transmisión in situ inducida por luz para la observación de la interacción líquido-materia blanda

Los fenómenos inducidos por la luz en alta resolución son interesantes en muchos campos como la nanoingeniería 1,2,3, la catálisis ^4,5 y la biofotónica⁶. Algunos diseños originales que permiten tales experimentos se pueden encontrar en la literatura, incluyendo modificaciones de los portamuestras 1,4,7,8,9 y la fibra óptica unida al microscopio ^10,11.

La combinación de iluminación de luz, un ambiente líquido y microscopía electrónica de transmisión (TEM) brinda una gran oportunidad para estudios detallados y dinámicos de procesos fotoinducidos. Sin embargo, la condición de alto vacío dentro del microscopio es bastante desfavorable para muchos líquidos, especialmente soluciones de agua. La encapsulación líquida, que lo protege del medio ambiente, se puede lograr utilizando algunas técnicas basadas principalmente en sustratos de grafeno 12, nitruro de silicio¹³ o carbono¹⁴. Además de la investigación en ciencia de materiales², las llamadas células líquidas ofrecen posibilidades para realizar observaciones microscópicas no convencionales en especímenes biológicos cerca de sus condiciones nativas¹⁵. Tales observaciones son extremadamente exigentes, especialmente para microorganismos vivos como las células bacterianas. El haz de electrones como radiación ionizante causa daños irreversibles a las muestras hidratadas, por lo que la dosis de electrones debe especificarse¹⁶. Esto es necesario para minimizar los efectos desfavorables, controlar el daño y evitar artefactos confusos. La dosis máxima óptima de electrones que permite observaciones de células vivas sigue siendo un tema cuestionable¹⁶, pero la dosis de 30 e⁻/nm² parece ser el valor umbral, al menos para las bacterias¹⁷.

Algunos de los temas de interés para tales estudios microscópicos son los procesos durante la terapia fotodinámica antimicrobiana (APDT)¹⁸. En resumen, la terapia procede de la siguiente manera. Las células bacterianas están rodeadas por el líquido fotosensible llamado fotosensibilizador. Cuando la iluminación de la luz se da a una longitud de onda específica, las especies reactivas citotóxicas de oxígeno (ROS) se generan a partir de la transferencia de energía o carga de las moléculas fotosensibilizadoras excitadas al oxígeno naturalmente presente en la solución. Los patógenos expuestos a ROS se inactivan rápidamente con una eficiencia muy alta, sin efectos secundarios¹⁹. La respuesta a la terapia varía para distintos microbios; por ejemplo, el impacto del mismo fotosensibilizador puede ser bastante diferente para las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas²⁰. En general, se ha establecido que el objetivo principal de ROS son las estructuras externas de las células, donde el daño resulta en trastornos funcionales de la membrana celular y, en consecuencia, conducen a la muerte de las bacterias^21,22. Sin embargo, el daño a los ácidos nucleicos y proteínas también puede considerarse una causa de inactivación¹⁸, por lo que aún se desconoce qué estructuras celulares son los principales objetivos durante este proceso¹⁹. Una comprensión más profunda de los procesos dañinos podría ayudar a mejorar esta terapia definitiva. En comparación con los métodos de microscopía óptica utilizados en la investigación de APDT²³, las técnicas TEM ofrecen más posibilidades de observar el mecanismo APDT con mayor resolución y aumento²⁴. TEM ya se ha utilizado con éxito para la observación celular durante la terapia en curso, lo que nos permitió estudiar el daño bacteriano grampositivo y describir los cambios que ocurren dentro de la pared celular en detalle ^6,25.

El protocolo actual presenta una configuración experimental adecuada para imágenes de alta resolución de la inactivación de bacterias inducida por la luz utilizando TEM, que requiere un sistema de iluminación de luz adecuado, la encapsulación de células con un líquido y un estricto control de la dosis de electrones. La bacteria utilizada para la observación fue Staphylococcus aureus, y se utilizó una solución de azul de metileno como fotosensibilizador. La configuración especial de iluminación de luz comprende un láser semiconductor sintonizable conectado directamente a la columna del microscopio utilizando la fibra de luz. Este diseño proporciona una irradiación uniforme en toda la muestra debido a la colocación casi paralela de la fibra óptica en el eje del microscopio. La luz monocromática de alta intensidad generada por el láser se puede utilizar para estudiar diversos efectos fotoquímicos. La luz utilizada en el experimento tenía una longitud de onda igual a 660 nm porque, en la región visible, el azul de metileno tiene picos de absorción a 613 nm y 664 nm²⁶. El protocolo para la encapsulación líquida se basa en sustratos de carbono, lo que hace que el procedimiento sea rápido y sin complicaciones. Finalmente, se presenta un método para la observación de TEM in situ de baja dosis de células en líquido. Se discuten las dificultades con respecto a la preparación de la muestra, los efectos de la dosis de electrones en la muestra sensible y la interpretación razonable de la imagen.