Microscopia Eletrônica de Transmissão In Situ Induzida pela Luz para Observação da Interação Matéria-Líquido Mole

Fenômenos induzidos pela luz em alta resolução são interessantes em muitos campos, como nanoengenharia ^1,2,3, catálise ^4,5 e biofotônica⁶. Alguns desenhos originais que permitem tais experimentos podem ser encontrados na literatura, incluindo modificações dos suportes amostrais 1,4,7,8,9 e da fibra óptica acoplada ao microscópio ^10,11.

A combinação de iluminação de luz, um ambiente líquido e microscopia eletrônica de transmissão (MET) oferece uma grande oportunidade para estudos detalhados e dinâmicos de processos fotoinduzidos. No entanto, a condição de alto vácuo dentro do microscópio é bastante desfavorável para muitos líquidos, especialmente soluções de água. O encapsulamento líquido, que o protege do meio ambiente, pode ser alcançado usando algumas técnicas baseadas principalmente em substratos de grafeno 12, nitreto de silício¹³ ou carbono¹⁴. Além das pesquisas em ciência dos materiais², as chamadas células líquidas oferecem possibilidades para a realização de observações microscópicas não convencionais em espécimes biológicos próximos às suas condições nativas¹⁵. Tais observações são extremamente exigentes, especialmente para microrganismos vivos, como células bacterianas. O feixe de elétrons como radiação ionizante causa danos irreversíveis aos corpos de prova hidratados, de modo que a dose de elétrons deve ser especificada¹⁶. Isso é necessário para minimizar os efeitos desfavoráveis, controlar os danos e evitar artefatos confusos. A dose máxima ideal de elétrons que permite observações de células vivas ainda é um tópico questionável¹⁶, mas a dose de 30 e⁻/nm² parece ser o valor limiar, pelo menos para as bactérias¹⁷.

Alguns dos assuntos de interesse para tais estudos microscópicos são processos durante a terapia fotodinâmica antimicrobiana (TAPA)¹⁸. Em suma, a terapia prossegue da seguinte forma. As células bacterianas são cercadas pelo líquido fotossensível chamado fotossensibilizador. Quando a iluminação da luz é dada em um comprimento de onda específico, as espécies citotóxicas reativas de oxigênio (ROS) são geradas a partir da transferência de energia ou carga das moléculas fotossensibilizadoras excitadas para o oxigênio naturalmente presente na solução. Patógenos expostos a ERO são rapidamente inativados com altíssima eficiência, sem efeitos colaterais¹⁹. A resposta à terapia varia para micróbios distintos – por exemplo, o impacto do mesmo fotossensibilizador pode ser bastante diferente para bactérias Gram-positivas e Gram-negativas²⁰. Em geral, estabeleceu-se que o principal alvo das ERO são as estruturas externas das células, onde o dano resulta em distúrbios funcionais da membrana celular e, consequentemente, leva à morte de bactérias^21,22. No entanto, danos aos ácidos nucleicos e proteínas também podem ser considerados uma causa de inativação¹⁸, por isso ainda não se sabe quais estruturas celulares são os principais alvos durante esse processo¹⁹. Uma compreensão mais profunda dos processos prejudiciais poderia ajudar a melhorar esta terapia definitiva. Em comparação com os métodos de microscopia de luz utilizados na pesquisa de APDT²³, as técnicas de MET dão mais possibilidades de olhar para o mecanismo de APDT com maior resolução e ampliação²⁴. O ETEM já foi utilizado com sucesso para observação celular durante a terapia em curso, o que nos permitiu estudar os danos bacterianos Gram-positivos e descrever detalhadamente as alterações ocorridas dentro da parede celular ^6,25.

O protocolo atual apresenta uma configuração experimental adequada para imagens de alta resolução de inativação de bactérias induzidas por luz usando TEM, que requer um sistema adequado de iluminação de luz, o encapsulamento de células com um líquido e um rigoroso controle de dose de elétrons. A bactéria utilizada para a observação foi Staphylococcus aureus, e uma solução de azul de metileno foi utilizada como fotossensibilizador. A configuração especial de iluminação de luz compreende um laser semicondutor ajustável conectado diretamente à coluna do microscópio usando a fibra de luz. Este projeto fornece irradiação uniforme em toda a amostra devido à colocação quase paralela da fibra óptica ao eixo do microscópio. A luz monocromática de alta intensidade gerada pelo laser pode então ser usada para estudar vários efeitos fotoquímicos. A luz utilizada no experimento apresentou comprimento de onda igual a 660 nm, pois, na região visível, o azul de metileno apresenta picos de absorção de 613 nm e 664 nm²⁶. O protocolo para encapsulamento de líquidos é baseado em substratos de carbono, o que torna o procedimento rápido e descomplicado. Finalmente, um método para observação de TEM in situ de baixa dose de células em líquido é apresentado. As dificuldades em relação à preparação da amostra, os efeitos da dose de elétrons sobre a amostra sensível e a interpretação razoável da imagem são discutidos.