Sıvı-Yumuşak Madde Etkileşiminin Gözlemlenmesi için Işık Kaynaklı In Situ İletim Elektron Mikroskobu
Summary
Mevcut protokol, bir ışık aydınlatma sistemi ile iletim elektron mikroskobu (TEM) modifikasyonlarını, sıvı hücrelerin üretimini ve bakteri hücreleri ile bir fotosensitizör arasındaki ışık kaynaklı etkileşimlerin yerinde TEM gözlemlerini açıklamaktadır. Numune hazırlama yöntemleri, elektron ışını hasarı ve görüntüleme de tartışılmaktadır.
Abstract
Mevcut protokol, in situ ışık kaynaklı gözlemler için iletim elektron mikroskobu (TEM) kurulumunun modifikasyonlarını açıklamaktadır. Cihazı imal etmek için objektif lens kutup parçasının üzerindeki elektron sütununa yerleştirilmiş bir cam optik fiber ve ayarlanabilir bir ışık kaynağı olan bir lazer kullanıldı. Aydınlatıcı harici bir ölçüm sistemi kullanılarak kalibre edildikten sonra, aydınlatmanın yoğunluğunu gözlemlenen işlemin ihtiyaçlarına göre ayarlamaya izin verir. Bu aydınlatma sistemi, şu anda yoğun araştırmalara konu olan antimikrobiyal fotodinamik terapi fenomenlerini görüntülemek için kullanılmıştır. Numune, bir karbon, grafen veya silikon nitrür substratı üzerinde bir bakteri süspansiyonu tespit edilerek, fazla çözeltinin lekelenmesiyle, fotosensitizör çözeltisinin tespit edilmesiyle, fazla sıvının tekrar lekelenmesiyle ve daha sonra sıvı hücrenin ikinci bir substrat veya grafen filmi ile birleştirilmesiyle hazırlandı. Görüntüleme deneyinin kendisi, düşük büyütme ve minimum dozda elektron kullanımı ile gözlem için doğru yeri seçmeyi ve daha sonra gerekli minimum elektron miktarı ile belirli aralıklarla sonraki görüntüleri yakalamak için ışık kaynağının döngüsel aktivasyonunu içerir. Her maruziyetin elektron dozu ve kullanılan aydınlatmanın zamanı ve yoğunluğu, gözlemlenen fenomenlerin karmaşıklığı nedeniyle dikkatlice kaydedilmelidir, çünkü aynı zamanda süreç hem ışık hem de elektron güdümlüdür. Gerçek deney yapıldıktan sonra, aynı dozda elektronların kullanıldığı, ancak ek ışık etkisi olmadan ve daha yüksek ışık dozları için daha küçük dozlarda elektronların kullanıldığı ek kontrol gözlemleri yapılmalıdır. Bu, ışığın neden olduğu mikroyapısal etkileri, hem yaşam hem de malzeme bilimi alanlarında elektronların neden olduğu etkilerden ayırt etmeyi mümkün kılar.
Introduction
Yüksek çözünürlükte ışık kaynaklı fenomenler, nanomühendislik 1,2,3, kataliz 4,5 ve biyofotonik6 gibi birçok alanda ilginçtir. Bu tür deneylere izin veren bazı orijinal tasarımlar, örnek tutucuların 1,4,7,8,9 ve mikroskopa bağlı optik fiber 10,11’in modifikasyonları da dahil olmak üzere literatürde bulunabilir.
Işık aydınlatması, sıvı bir ortam ve transmisyon elektron mikroskobu (TEM) kombinasyonu, foto-indüklenen süreçlerin ayrıntılı, dinamik çalışmaları için harika bir fırsat sunar. Bununla birlikte, mikroskop içindeki yüksek vakum koşulu, birçok sıvı, özellikle de su çözeltileri için oldukça elverişsizdir. Onu çevreden koruyan sıvı kapsülleme, esas olarak grafen12, silikon nitrür 13 veya karbon14 substratlarına dayanan birkaç teknik kullanılarak elde edilebilir. Malzeme bilimi2’deki araştırmalara ek olarak, sözde sıvı hücreler, doğal koşullarına yakın biyolojik örnekler üzerinde alışılmadık mikroskobik gözlemler yapma olanakları sunar15. Bu tür gözlemler, özellikle bakteri hücreleri gibi canlı mikroorganizmalar için son derece zordur. İyonlaştırıcı radyasyon olarak elektron ışını, hidratlanmış numunelerde geri dönüşü olmayan hasara neden olur, bu nedenle elektron dozubelirtilmelidir 16. Bu, olumsuz etkileri en aza indirmek, hasarı kontrol etmek ve kafa karıştırıcı yapıtlardan kaçınmak için gereklidir. Canlı hücrelerin gözlemlenmesine izin veren optimal maksimum elektron dozu hala şüpheli bir konu16’dır, ancak 30 e-/ nm2 dozu, en azından bakteri17 için eşik değer gibi görünmektedir.
Bu tür mikroskobik çalışmalar için ilgi çekici konulardan bazıları, antimikrobiyal fotodinamik tedavi (APDT) sırasındaki süreçlerdir18. Kısacası terapi şu şekilde ilerler. Bakteri hücreleri, fotosensitizör adı verilen ışığa duyarlı sıvı ile çevrilidir. Işık aydınlatması belirli bir dalga boyunda verildiğinde, sitotoksik reaktif oksijen türleri (ROS), uyarılmış fotosensitizör moleküllerden çözeltide doğal olarak bulunan oksijene enerji veya yük transferinden üretilir. ROS’a maruz kalan patojenler, hiçbir yan etkisi olmadan, çok yüksek verimlilikle hızlı bir şekilde inaktive edilir19. Tedaviye verilen yanıt farklı mikroplar için değişir – örneğin, aynı fotosensitizörün etkisi Gram-pozitif ve Gram-negatif bakteriler için oldukça farklı olabilir20. Genel olarak, ROS’un ana hedefinin, hasarın hücre zarının fonksiyonel bozukluklarına neden olduğu ve sonuç olarak bakterilerin ölümüne yol açtığı hücrelerin dış yapıları olduğu tespit edilmiştir21,22. Bununla birlikte, nükleik asitlere ve proteinlere verilen hasar, inaktivasyonun bir nedeni olarak da düşünülebilir18, bu nedenle bu işlem sırasında hangi hücre yapılarının ana hedefler olduğu hala bilinmemektedir19. Zarar verici süreçlerin daha derin bir şekilde anlaşılması, bu kesin tedavinin iyileştirilmesine yardımcı olabilir. APDT araştırması23’te kullanılan ışık mikroskobu yöntemleriyle karşılaştırıldığında, TEM teknikleri APDT mekanizmasına daha yüksek çözünürlük ve büyütme ile bakmak için daha fazla olanak sağlar24. TEM, devam eden tedavi sırasında hücre gözlemi için zaten başarıyla kullanılmıştır, bu da Gram-pozitif bakteri hasarını incelememize ve hücre duvarında meydana gelen değişiklikleri ayrıntılı olarak tanımlamamıza izin verdi 6,25.
Mevcut protokol, uygun bir ışık aydınlatma sistemi, hücrelerin bir sıvı ile kapsüllenmesi ve sıkı elektron dozu kontrolü gerektiren TEM kullanarak ışığa bağlı bakteri inaktivasyonunun yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi için uygun bir deneysel kurulum sunmaktadır. Gözlem için kullanılan bakteriler Staphylococcus aureus idi ve fotosensitizör olarak metilen mavisi bir çözelti kullanıldı. Özel ışık aydınlatma kurulumu, ışık fiberi kullanılarak doğrudan mikroskop kolonuna bağlanan ayarlanabilir bir yarı iletken lazerden oluşur. Bu tasarım, optik fiberin mikroskop eksenine neredeyse paralel yerleştirilmesi nedeniyle numune boyunca eşit ışınlama sağlar. Lazer tarafından üretilen yüksek yoğunluklu monokromatik ışık daha sonra çeşitli fotokimyasal etkileri incelemek için kullanılabilir. Deneyde kullanılan ışık 660 nm’ye eşit bir dalga boyuna sahipti, çünkü görünür bölgede metilen mavisi 613 nm ve 664 nm26’da absorpsiyon zirvelerine sahipti. Sıvı kapsülleme protokolü, prosedürü hızlı ve karmaşık hale getiren karbon substratlarına dayanmaktadır. Son olarak, sıvı içindeki hücrelerin düşük doz in situ TEM gözlemi için bir yöntem sunulmuştur. Numune hazırlama ile ilgili zorluklar, hassas numune üzerindeki elektron dozu etkileri ve makul görüntü yorumlama tartışılmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aydınlatıcının kurulumu ve devreye alınması temel servis bilgisi gerektirir ve mikroskopa zarar verebilir. Işığı mikroskopa tanıtmanın en basit yolu, optik fiberi, genellikle TEM sapma bobinleri ve ek dedektörler için yer bulunan objektif lensin üstünden bağlamaktır. Aynı konumun numune vakum kilidini ve numune kurulum mekanizmasını barındırdığı eski üstten girişli cihazlardan daha fazla boş alan da beklenebilir. Bu yapılandırma, örnek bir aydınlatıcı tasarımı içeren önceki bir rapo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Araştırma Miniatura hibesi (2019/03/X/NZ3/02100, Ulusal Bilim Merkezi, Polonya) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Carbon film on 200 mesh copper grid | Agar Scientific | AGS160 | The standard TEM grids for observations and liquid cell preparation |
| Crossover Tweezers | Dumont | N5 | The tweezers are neecesarry for liquid cell preparation |
| Photodiode Power Sensor | ThorLabs | S130C | The sensor used for light intensity measurement |
| Polyimide-Coated Multimode Fiber | Thorlabs | FG400UEP | Must be built into the microscope using the on-site built adapter, according to the 10.1016/j.ultramic.2021.113388 |
| Transmission Electron Microscope | Hitachi | H-800 | Can be replaced with any side-entry microscope, available for modification |
| Tuneable Diode Laser | CNI | MRL-III-660D | The light wavelength must be chosen basing on photosensitizer's absorption spectrum |
References
- Vadai, M., Angell, D. K., Hayee, F., Sytwu, K., Dionne, J. A. In-situ observation of plasmon-controlled photocatalytic dehydrogenation of individual palladium nanoparticles. Nature Communications. 9 (1), 1-8 (2018).
- Weng, B., et al. Visualizing light-induced dynamic structural transformations of Au clusters-based photocatalyst via in situ TEM. Nano Research. 12 (1), 1-5 (2021).
- Cao, K., et al. In situ TEM investigation on ultrafast reversible lithiation and delithiation cycling of Sn@C yolk-shell nanoparticles as anodes for lithium ion batteries. Nano Energy. 40, 187-194 (2017).
- Cavalca, F., et al. In situ transmission electron microscopy of light-induced photocatalytic reactions. Nanotechnology. 23 (7), 075705 (2012).
- Tung, C. -. W., et al. Light-induced activation of adaptive junction for efficient solar-driven oxygen evolution: In situ unraveling the interfacial metal-silicon junction. Advanced Energy Materials. 9 (31), 1901308 (2019).
- Żak, A. M., Kaczmarczyk, O., Piksa, M., Matczyszyn, K. Light-induced in situ transmission electron microscopy: Novel approach for antimicrobial photodynamic therapy imaging. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 35, 102463 (2021).
- Shindo, D., et al. Development of a multifunctional TEM specimen holder equipped with a piezodriving probe and a laser irradiation port. Journal of Electron Microscopy. 58 (4), 245-249 (2009).
- Zhang, C., et al. Photosensing performance of branched CdS/ZnO heterostructures as revealed by in situ TEM and photodetector tests. Nanoscale. 6 (14), 8084-8090 (2014).
- Zhang, C., et al. Statistically analyzed photoresponse of elastically bent CdS nanowires probed by light-compatible in situ high-resolution TEM. Nano Letters. 16 (10), 6008-6013 (2016).
- Yoshida, K., Yamasaki, J., Tanaka, N. In situ high-resolution transmission electron microscopy observation of photodecomposition process of poly-hydrocarbons on catalytic TiO2 films. Applied Physics Letters. 84 (14), 2542-2544 (2004).
- Yoshida, K., Nozaki, T., Hirayama, T., Tanaka, N. In situ high-resolution transmission electron microscopy of photocatalytic reactions by excited electrons in ionic liquid. Journal of Electron Microscopy. 56 (5), 177-180 (2007).
- Textor, M., De Jonge, N. Strategies for preparing graphene liquid cells for transmission electron microscopy. Nano Letters. 18 (6), 3313-3321 (2018).
- Ring, E. A., De Jonge, N. Microfluidic system for transmission electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 16 (5), 622-629 (2010).
- Inayoshi, Y., Minoda, H. A carbon sandwich environmental cell for wet specimens. Journal of Electron Microscopy. 62 (6), 623-628 (2013).
- Koo, K., Dae, K. S., Hahn, Y. K., Yuk, J. M. Live cell electron microscopy using graphene veils. Nano Letters. 20 (6), 4708-4713 (2020).
- De Jonge, N., Peckys, D. B. Live cell electron microscopy is probably impossible. ACS Nano. 10 (10), 9061-9063 (2016).
- Kennedy, E., Nelson, E. M., Damiano, J., Timp, G. Gene expression in electron-beam-irradiated bacteria in reply to "live cell electron microscopy is probably impossible.". ACS Nano. 11 (1), 3-7 (2017).
- Alves, E., et al. An insight on bacterial cellular targets of photodynamic inactivation. Future Medicinal Chemistry. 6 (2), 141-164 (2014).
- Cieplik, F., et al. Antimicrobial photodynamic therapy-What we know and what we don’t. Critical Reviews in Microbiology. 44 (5), 571-589 (2018).
- Huang, L., et al. Type I and Type II mechanisms of antimicrobial photodynamic therapy: An in vitro study on gram-negative and gram-positive bacteria. Lasers in Surgery and Medicine. 44 (6), 490-499 (2012).
- Caminos, D. A., Spesia, M. B., Pons, P., Durantini, E. N. Mechanisms of Escherichia coli photodynamic inactivation by an amphiphilic tricationic porphyrin and 5,10,15,20-tetra(4-N,N,N-trimethylammoniumphenyl) porphyrin. Photochemical and Photobiological Sciences. 7 (9), 1071-1078 (2008).
- Chu, J. C. H., Chin, M. L., Wong, C. T. T., Hui, M., Lo, P. C., Ng, D. K. P. One-pot synthesis of a cyclic antimicrobial peptide-conjugated phthalocyanine for synergistic chemo-photodynamic killing of multidrug-resistant bacteria. Advanced Therapeutics. 4 (3), 1-10 (2021).
- Rogers, S., Honma, K., Mang, T. S. Confocal fluorescence imaging to evaluate the effect of antimicrobial photodynamic therapy depth on P. gingivalis and T. denticola biofilms. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 23, 18-24 (2018).
- Maldonado-Carmona, N., et al. Porphyrin-loaded lignin nanoparticles against bacteria: A photodynamic antimicrobial chemotherapy application. Frontiers in Microbiology. 11, 606185 (2020).
- Żak, A. M., Kaczmarczyk, O., Piksa, M., Grzęda, J., Matczyszyn, K. Fiber-optic sample illuminator design for the observation of light induced phenomena with transmission electron microscopy in situ: Antimicrobial photodynamic therapy. Ultramicroscopy. 230, 113388 (2021).
- Dinh, V. P., et al. Insight into the adsorption mechanisms of methylene blue and chromium(III) from aqueous solution onto pomelo fruit peel. RSC Advances. 9 (44), 25847-25860 (2019).
- Żak, A. Guide to controlling the electron dose to improve low-dose imaging of sensitive samples. Micron. 145, 103058 (2021).
- Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallographica Section D. 74 (6), 560-571 (2018).
- Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. Variations on negative stain electron microscopy methods: Tools for tackling challenging systems. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
- Booth, D. S., Avila-Sakar, A., Cheng, Y. Visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain EM: From grid preparation to image acquisition. Journal of Visualized Experiments. (58), (2011).
- Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized negative staining: A high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (90), e51087 (2014).
- Miller, B. K., Crozier, P. A. System for in situ UV-visible illumination of environmental transmission electron microscopy samples. Microscopy and Microanalysis. 19 (2), 461-469 (2013).
- Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336 (6077), 61-64 (2012).
- Schneider, N. M., et al. Electron-Water interactions and implications for liquid cell electron microscopy. Journal of Physical Chemistry C. 118 (38), 22373-22382 (2014).
