المجهر الإلكتروني للانتقال في الموقع الناجم عن الضوء لمراقبة تفاعل المادة السائلة اللينة

الظواهر التي يسببها الضوء بدقة عالية مثيرة للاهتمام في العديد من المجالات مثل الهندسة النانوية¹،²،³ ، والتحفيز⁴،^{5 ،} والضوئيات الحيوية⁶. يمكن العثور على بعض التصاميم الأصلية التي تسمح بمثل هذه التجارب في الأدبيات ، بما في ذلك تعديلات أصحاب العينات¹،^4،7،⁸،⁹ والألياف البصرية المرفقة بالمجهر^10،11.

إن الجمع بين الإضاءة الضوئية والبيئة السائلة والمجهر الإلكتروني الناقل (TEM) يعطي فرصة كبيرة للدراسات التفصيلية والديناميكية للعمليات المستحثة بالصور. ومع ذلك ، فإن حالة الفراغ العالي داخل المجهر غير مواتية إلى حد ما للعديد من السوائل ، وخاصة المحاليل المائية. يمكن تحقيق التغليف السائل ، الذي يحميه من البيئة ، باستخدام بعض التقنيات التي تعتمد بشكل أساسي على ركائز الجرافين 12 أو نيتريد السيليكون¹³ أو الكربون¹⁴. بالإضافة إلى الأبحاث في علوم المواد² ، توفر ما يسمى بالخلايا السائلة إمكانيات لإجراء ملاحظات مجهرية غير تقليدية على العينات البيولوجية بالقرب من ظروفها الأصلية¹⁵. هذه الملاحظات صعبة للغاية ، خاصة بالنسبة للكائنات الحية الدقيقة مثل الخلايا البكتيرية. تسبب حزمة الإلكترون كإشعاع مؤين أضرارا لا رجعة فيها للعينات المائية ، لذلك يجب تحديد جرعة الإلكترون¹⁶. هذا ضروري لتقليل الآثار غير المواتية ، والتحكم في الضرر ، وتجنب القطع الأثرية المربكة. لا تزال الجرعة القصوى المثلى للإلكترون التي تسمح بمراقبة الخلايا الحية موضوعا مشكوكا فيه¹⁶ ، ولكن يبدو أن جرعة 30 e⁻ / nm² هي قيمة العتبة ، على الأقل بالنسبة للبكتيريا¹⁷.

بعض الموضوعات ذات الاهتمام لمثل هذه الدراسات المجهرية هي عمليات أثناء العلاج الضوئي الديناميكي المضاد للميكروبات (APDT)¹⁸. باختصار ، يستمر العلاج على النحو التالي. الخلايا البكتيرية محاطة بسائل حساس للضوء يسمى المحسس الضوئي. عندما يتم إعطاء إضاءة ضوئية بطول موجي محدد ، يتم توليد أنواع الأكسجين التفاعلي السام للخلايا (ROS) من الطاقة أو نقل الشحنة من جزيئات المحسس الضوئي المثارة إلى الأكسجين الموجود بشكل طبيعي في المحلول. يتم تعطيل مسببات الأمراض المعرضة ل ROS بسرعة بكفاءة عالية جدا ، دون أي آثار جانبية¹⁹. تختلف الاستجابة للعلاج بالنسبة للميكروبات المتميزة – على سبيل المثال ، قد يكون تأثير نفس المحسس الضوئي مختلفا تماما بالنسبة للبكتيريا إيجابية الجرام وسالبة الجرام²⁰. بشكل عام ، ثبت أن الهدف الرئيسي ل ROS هو الهياكل الخارجية للخلايا ، حيث يؤدي الضرر إلى اضطرابات وظيفية في غشاء الخلية ، وبالتالي يؤدي إلى وفاة البكتيريا^21,22. ومع ذلك ، فإن تلف الأحماض النووية والبروتيناتيمكن اعتباره أيضا سببا للتعطيل¹⁸ ، لذلك لا يزال من غير المعروف أي هياكل الخلايا هي الأهداف الرئيسية خلال هذه العملية¹⁹. يمكن أن يساعد الفهم الأعمق للعمليات الضارة في تحسين هذا العلاج النهائي. بالمقارنة مع طرق الفحص المجهري الضوئي المستخدمة في أبحاث APDT²³ ، توفر تقنيات TEM المزيد من الإمكانيات للنظر إلى آلية APDT بدقة أعلى وتكبير²⁴. تم بالفعل استخدام TEM بنجاح لمراقبة الخلايا أثناء العلاج المستمر ، مما سمح لنا بدراسة تلف البكتيريا إيجابية الجرام ووصف التغييرات التي تحدث داخل جدار الخلية بالتفصيل ^6,25.

يقدم البروتوكول الحالي إعدادا تجريبيا مناسبا للتصوير عالي الدقة لتعطيل البكتيريا المستحثة بالضوء باستخدام TEM ، والذي يتطلب نظاما مناسبا لإضاءة الضوء ، وتغليف الخلايا بسائل ، والتحكم الصارم في جرعة الإلكترون. كانت البكتيريا المستخدمة في الملاحظة هي المكورات العنقودية الذهبية ، وتم استخدام محلول أزرق الميثيلين كمحسس للضوء. يتكون إعداد الإضاءة الضوئية الخاص من ليزر أشباه موصلات قابل للضبط متصل مباشرة بعمود المجهر باستخدام الألياف الضوئية. يوفر هذا التصميم تشعيعا موحدا في جميع أنحاء العينة بسبب الوضع المتوازي تقريبا للألياف البصرية على محور المجهر. يمكن بعد ذلك استخدام الضوء أحادي اللون ذي الكثافة العالية الناتج عن الليزر لدراسة التأثيرات الكيميائية الضوئية المختلفة. كان للضوء المستخدم في التجربة طول موجي يساوي 660 نانومتر لأنه في المنطقة المرئية ، يكون للميثيلين الأزرق قمم امتصاص عند 613 نانومتر و 664 نانومتر²⁶. يعتمد بروتوكول تغليف السائل على ركائز الكربون ، مما يجعل الإجراء سريعا وغير معقد. أخيرا ، يتم تقديم طريقة لجرعة منخفضة في الموقع TEM مراقبة الخلايا في السائل. وتناقش الصعوبات المتعلقة بإعداد العينة، وتأثيرات جرعة الإلكترون على العينة الحساسة، وتفسير الصورة المعقول.