Licht-geïnduceerde in situ transmissie elektronenmicroscopie voor observatie van de interactie tussen vloeistof en zachte materie

Lichtgeïnduceerde verschijnselen in hoge resolutie zijn interessant op vele gebieden, zoals nano-engineering ^1,2,3, katalyse ^4,5 en biofotonica⁶. Enkele originele ontwerpen die dergelijke experimenten mogelijk maken, zijn te vinden in de literatuur, inclusief modificaties van de monsterhouders 1,4,7,8,9 en de optische vezel bevestigd aan de microscoop^10,11.

De combinatie van lichtverlichting, een vloeibare omgeving en transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) biedt een geweldige kans voor gedetailleerde, dynamische studies van foto-geïnduceerde processen. De hoogvacuümconditie in de microscoop is echter nogal ongunstig voor veel vloeistoffen, vooral wateroplossingen. Vloeibare inkapseling, die het beschermt tegen de omgeving, kan worden bereikt met behulp van een paar technieken die voornamelijk zijn gebaseerd op grafeen¹², siliciumnitride¹³ of koolstof¹⁴ substraten. Naast onderzoek in materiaalkunde² bieden zogenaamde vloeibare cellen mogelijkheden voor het uitvoeren van onconventionele microscopische waarnemingen op biologische specimens in de buurt van hun oorspronkelijke omstandigheden¹⁵. Dergelijke waarnemingen zijn uiterst veeleisend, vooral voor levende micro-organismen zoals bacteriële cellen. De elektronenbundel als ioniserende straling veroorzaakt onomkeerbare schade aan de gehydrateerde monsters, dus de elektronendosis moet worden^{gespecificeerd 16}. Dit is nodig om ongunstige effecten te minimaliseren, de schade te beheersen en verwarrende artefacten te voorkomen. De optimale maximale elektronendosis die waarnemingen van levende cellen mogelijk maakt is nog een twijfelachtig onderwerp¹⁶, maar de dosis van 30 e⁻/nm² lijkt de drempelwaarde te zijn, althans voor bacteriën¹⁷.

Enkele van de onderwerpen die van belang zijn voor dergelijke microscopische studies zijn processen tijdens antimicrobiële fotodynamische therapie (APDT)¹⁸. Kortom, de therapie verloopt als volgt. De bacteriële cellen worden omringd door de lichtgevoelige vloeistof genaamd photosensitizer. Wanneer lichtverlichting wordt gegeven op een specifieke golflengte, worden de cytotoxische reactieve zuurstofsoorten (ROS) gegenereerd uit energie- of ladingsoverdracht van de geëxciteerde fotosensitizermoleculen naar de zuurstof die van nature in de oplossing aanwezig is. Pathogenen blootgesteld aan ROS worden snel geïnactiveerd met een zeer hoge efficiëntie, zonder bijwerkingen¹⁹. De respons op de therapie varieert voor verschillende microben – de impact van dezelfde fotosensitizer kan bijvoorbeeld heel anders zijn voor Gram-positieve en Gram-negatieve bacteriën²⁰. In het algemeen is vastgesteld dat het belangrijkste doelwit van ROS de buitenste structuren van cellen zijn, waar schade resulteert in functionele stoornissen van het celmembraan en bijgevolg leidt tot de dood van bacteriën^21,22. Schade aan nucleïnezuren en eiwitten kan echter ook worden beschouwd als een oorzaak van inactivatie¹⁸, dus het is nog onbekend welke celstructuren de belangrijkste doelwitten zijn tijdens dit proces¹⁹. Een dieper inzicht in de schadelijke processen zou kunnen helpen om deze definitieve therapie te verbeteren. Vergeleken met de lichtmicroscopiemethoden die in APDT-onderzoek²³ worden gebruikt, geven TEM-technieken meer mogelijkheden om naar het APDT-mechanisme te kijken met een hogere resolutie en vergroting²⁴. TEM is al met succes gebruikt voor celobservatie tijdens de lopende therapie, waardoor we Gram-positieve bacterieschade konden bestuderen en de veranderingen in de celwand in detail konden beschrijven ^6,25.

Het huidige protocol presenteert een geschikte experimentele opstelling voor beeldvorming met hoge resolutie van door licht geïnduceerde bacteriën inactivatie met behulp van TEM, wat een goed lichtverlichtingssysteem, de inkapseling van cellen met een vloeistof en strikte elektronendosiscontrole vereist. De bacteriën die voor de observatie werden gebruikt , waren Staphylococcus aureus en een methyleenblauwoplossing werd gebruikt als fotosensitizer. De speciale lichtverlichtingsopstelling bestaat uit een instelbare halfgeleiderlaser die rechtstreeks op de microscoopkolom is aangesloten met behulp van de lichtvezel. Dit ontwerp biedt een uniforme bestraling in het hele monster vanwege de bijna parallelle plaatsing van de optische vezel op de microscoopas. Monochroom licht van hoge intensiteit gegenereerd door de laser kan vervolgens worden gebruikt om verschillende fotochemische effecten te bestuderen. Het licht dat in het experiment werd gebruikt, had een golflengte gelijk aan 660 nm omdat methyleenblauw in het zichtbare gebied absorptiepieken heeft bij 613 nm en 664 nm²⁶. Het protocol voor vloeibare inkapseling is gebaseerd op koolstofsubstraten, waardoor de procedure snel en ongecompliceerd is. Ten slotte wordt een methode voor lage dosis in situ TEM-observatie van cellen in vloeistof gepresenteerd. De moeilijkheden met betrekking tot de monstervoorbereiding, de elektronendosiseffecten op het gevoelige monster en een redelijke beeldinterpretatie worden besproken.