Quantificazione completa rispetto a quella subregionale del carico di amiloide-beta sulle sezioni cerebrali del topo
Summary
Il presente protocollo descrive e confronta la procedura per eseguire un’analisi a regione o sottoregione di interesse di sezioni cerebrali di topo sagittale per quantificare il carico di amiloide-beta nel modello murino transgenico APP / PS1 della malattia di Alzheimer.
Abstract
L’accumulo extracellulare di placche amiloide-beta (Aβ) è uno dei principali segni patologici della malattia di Alzheimer (AD) ed è l’obiettivo dell’unico trattamento modificante la malattia approvato dalla FDA per l’AD. Di conseguenza, l’uso di modelli murini transgenici che sovraesprimono la proteina precursore dell’amiloide e quindi accumulano placche Aβ cerebrali sono ampiamente utilizzati per modellare l’AD umano nei topi. Pertanto, i saggi immunologici, tra cui il saggio immunoassorbinte enzimatico (ELISA) e l’immunocolorazione, misurano comunemente il carico di Aβ nei tessuti cerebrali derivati da topi transgenici AD. Sebbene i metodi per il rilevamento e la quantificazione di Aβ siano stati ben stabiliti e documentati, l’impatto della dimensione della regione di interesse selezionata nel tessuto cerebrale sulle misurazioni del carico Aβ a seguito di immunocolorazione non è stato riportato. Pertanto, l’attuale protocollo mirava a confrontare le misurazioni del carico Aβ tra le regioni complete e secondarie di interesse utilizzando un software di analisi delle immagini. I passaggi coinvolti nella preparazione del tessuto cerebrale, nell’immunocolorazione della sezione cerebrale fluttuante, nell’imaging e nella quantificazione del carico di Aβ in intere sottoregioni di interesse sono descritti utilizzando sezioni cerebrali derivate da topi maschi doppio transgenico APP / PS1 di 13 mesi. L’attuale protocollo e i risultati forniscono preziose informazioni sull’impatto della dimensione della regione di interesse sulla quantificazione dell’area Aβ-positiva e mostrano una forte correlazione tra l’area Aβ-positiva ottenuta utilizzando le analisi complete e sottoregioni di interesse per sezioni cerebrali derivate da topi MASCHI APP/PS1 di 13 mesi che mostrano una diffusa deposizione di Aβ.
Introduction
Il morbo di Alzheimer (AD), la sesta causa di morte negli Stati Uniti, continua ad essere una minaccia per la salute pubblica, con una stima di 6,2 milioni di americani che vivono con AD. Si prevede che raggiungerà i 13,8 milioni entro il 20601. Ad oggi, la gestione sintomatica attraverso farmaci come gli inibitori della colinesterasi e la memantina è il corso primario del trattamento2. L’AD è caratterizzato da manifestazioni neuropatologiche come la deposizione extracellulare di placche di amiloide-beta (Aβ) e l’accumulo intracellulare iperfosforilato di tau sotto forma di grovigli neurofibrillari 3,4. Formato da una scissione endoproteolitica della proteina precursore dell’amiloide (APP) tramite beta- e gamma-secretasi, aggrega ambrega per formare oligomeri e fibrille, portando a effetti neurotossici5. Aβ è stato ipotizzato per svolgere un ruolo patologico primario dal 1980, ed è l’obiettivo terapeutico dell’unica terapia modificante la malattia approvata dalla FDA per AD6. Di conseguenza, i modelli murini transgenici di AD che ospitano mutazioni nei geni con conseguente robusto accumulo cerebrale di Aβ sono stati ampiamente utilizzati per la ricerca preclinica sull’AD sin dai primi anni 19907.
Il rilevamento di specie Aβ in questi cervelli di topo transgenico AD viene generalmente effettuato utilizzando due saggi immunologici: saggio immunoassorbente enzimatico (ELISA) e immunocolorazione. Il primo test consente la determinazione quantitativa di diverse specie di Aβ ed è meno dispendioso in termini di tempo rispetto all’immunocolorazione, che richiede diverse fasi sequenziali di elaborazione e imaging dei tessuti, tra cui sezionamento tissutale, immunocolorazione, imaging e quantificazione8. Inoltre, i risultati ottenuti a seguito dell’immunocolorazione sono semi-quantitativi8. Tuttavia, la capacità di localizzare spazialmente Aβ rende l’immunocolorazione un approccio interessante per il rilevamento di Aβ nei tessuti cerebrali8.
Durante l’utilizzo dell’immunocolorazione Aβ, diversi paradigmi di quantificazione sono stati impiegati da diversi gruppi di ricerca. Ad esempio, alcuni gruppi di ricerca quantificano il carico Aβ nell’intera regione di interesse (corteccia o ippocampo), mentre altri quantificano il carico Aβ in una specifica sottoregione di interesse (una parte della corteccia o dell’ippocampo)9,10,11. Sebbene i metodi per il rilevamento e la quantificazione di Aβ siano stati ben stabiliti e documentati, l’impatto della dimensione della regione di interesse sulle misurazioni del carico Aβ a seguito di immunocolorazione non è stato riportato. Pertanto, l’attuale protocollo mirava a confrontare le misurazioni del carico Aβ tra le regioni complete e secondarie di interesse utilizzando un software di analisi delle immagini, ImageJ.
L’attuale studio ha utilizzato topi maschi doppio transgenico APP/PS1 di 13 mesi, che esprimono un APP chimerico topo/umano e una presenilina 1 mutante, per modellare l’insorgenza precoce di AD12. I depositi di Aβ iniziano a svilupparsi entro i 6-7 mesi di età e si osserva un abbondante accumulo di Aβ sia nella corteccia che nell’ippocampo di questi topi entro i 9-10 mesi di età di12 anni. I peptidi amiloidi transgenici e l’oloproteina possono essere rilevati da 6E10-immunocolor13, rendendolo un modello animale desiderabile per il presente protocollo. La procedura qui trattata include la preparazione del tessuto cerebrale, l’immunocolorazione di sezioni fluttuanti, l’imaging e la quantificazione del carico di Aβ in intere o sottoregioni di interesse. L’analisi mostra una forte correlazione tra la quantificazione completa e sub-regionale, indicando un robusto accordo tra questi due metodi nelle sezioni del tessuto cerebrale derivate da topi maschi APP / PS1 di 13 mesi che mostrano abbondanti depositi di Aβ.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo qui descritto delinea la procedura per la preparazione dell’emi-cervello per il sezionamento sagittale, la colorazione immunofluorescente dei depositi di Aβ utilizzando l’anticorpo 6E10 su sezioni fluttuanti, l’imaging delle sezioni cerebrali macchiate di Aβ seguito dalla quantificazione dei depositi di Aβ nella corteccia e nell’ippocampo del tessuto cerebrale di topo utilizzando un software di analisi delle immagini. Mentre ci sono protocolli pubblicati per quantificare il carico di Aβ nelle sezioni 8,10 del tessuto cerebrale, questo protocollo descrive i passaggi coinvolti nella quantificazione del carico di Aβ nell’intera iso-corteccia (indicata come corteccia) e ippocampo rispetto al carico Aβ in una sottoregione di interesse nella corteccia e nell’ippocampo, quando questo può essere desiderato. Viene inoltre fornita la correlazione tra le analisi delle intere e delle sottoregioni di interesse.
Ci sono diversi passaggi critici nel protocollo. In primo luogo, il protocollo descritto è per sezioni di tessuto cerebrale spesse 20 μm sottoposte a immunocolorazione fluttuante, che si traduce in una penetrazione ottimale degli anticorpi all’interno della sezionetissutale 18. La tecnica del flottante può richiedere il trasferimento manuale delle sezioni tissutali tra le diverse soluzioni durante la colorazione immunofluorescente e un’attenta manipolazione delle sezioni tissutali durante la procedura. Ciò è particolarmente importante quando le sezioni tissutali sono immerse nella soluzione di acido formico al 70% per il recupero dell’antigene nel protocollo corrente, aumentando la fragilità dei tessuti per le sezioni sottili. Approcci alternativi al protocollo descritto includono l’uso di sezioni di tessuto più spesse (ad esempio, 30-40 μm) o l’utilizzo di sezioni di tessuto che sono direttamente montate su vetrini caricati positivamente prima della colorazione immunofluorescente. In secondo luogo, il protocollo qui descritto utilizza un anticorpo 6E10 marcato fluorescentemente. Oltre a utilizzare l’anticorpo 6E10 marcato con fluorescenza, gli anticorpi 6E10 non fluorescenti (ad esempio, l’anticorpo 6E10 coniugato con perossidasi di rafano) possono anche essere utilizzati per rilevare il carico di Aβ nelle sezioni del tessuto cerebrale e l’attuale protocollo può essere adattato per quantificare le macchie immunochimiche Aβ-positive nelle sezioni del tessuto cerebrale come descritto in precedenza8 . In terzo luogo, l’accuratezza dei risultati per la quantificazione del carico Aβ dipenderà dalla selezione della soglia appropriata nel software di analisi, che dipende dal background del tessuto e dall’intensità del segnale. La selezione della soglia deve essere eseguita dall’utente finale in modo tale che solo le macchie Aβ-positive siano selezionate per la quantificazione. L’intervento dell’utente finale è necessario per ottimizzare la soglia specifica che può essere applicata a tutte le immagini per garantire l’accuratezza dell’impostazione della soglia. In quarto luogo, poiché l’analisi della sottoregione di interesse richiede la selezione di una piccola regione di interesse nella sezione tissue, per questa analisi sono stati utilizzati due lettori indipendenti. Per mantenere l’indipendenza e l’accecamento durante la raccolta dei dati, tutte le immagini sono state codificate numericamente; la sequenza di analisi delle immagini è stata randomizzata tra i lettori in modo tale che i diversi lettori analizzassero immagini diverse in un dato momento e i dati sono stati inviati alla fine di ogni settimana. A causa della maggiore probabilità di variabilità tra lettori nella selezione della regione di interesse nell’analisi della sottoregione di interesse, i lettori sono stati addestrati utilizzando diverse immagini campione per ottimizzare la selezione della regione nella corteccia e nell’ippocampo prima di iniziare la raccolta dei dati. Questa formazione è fondamentale per ridurre la variabilità tra lettori e, come si può vedere (Figura 5A, B), l’area 6E10-positiva riportata da entrambi i lettori mostra un forte accordo relativo nel presente studio.
L’attuale protocollo e i risultati forniscono preziose informazioni sull’impatto della dimensione della regione di interesse sulla quantificazione dell’area Aβ-positiva. Si prevede che una regione di interesse più ampia rappresenti il tessuto più di una regione di interesse più piccola. Pertanto, il campionamento di un tessuto più grande è auspicabile per quantificare con precisione il carico di Aβ nei tessuti. Tuttavia, nel caso di distribuzione omogenea del carico Aβ all’interno del tessuto, una regione di campionamento più piccola è generalmente considerata una buona rappresentazione del tessuto più grande in analisi. Gli attuali risultati dello studio lo confermano, e il carico di Aβ nell’intera corteccia e nell’ippocampo era un forte correlato del carico di Aβ in una sottoregione selezionata della corteccia e dell’ippocampo (Figura 5C, D). Per confermare ulteriormente l’accordo tra le analisi complete e le sottoregioni di interesse, è stata confrontata l’area media 6E10-positiva nella corteccia e nell’ippocampo e non è stata trovata alcuna differenza tra i due metodi (Figura 5E). Ciò conferma che uno di questi metodi (analisi completa o sub-regione) produce misurazioni del carico Aβ comparabili.
Il protocollo attuale presenta alcune limitazioni. I due metodi (analisi dell’intera regione rispetto alla sottoregione) potrebbero non essere sempre utilizzati in modo intercambiabile. La scelta di utilizzare l’analisi completa o sub-regione dipenderà dalla distribuzione regionale di Aβ all’interno del tessuto, che è influenzata dall’età, dal sesso e dal ceppo del modello murino AD. A 13 mesi, il carico di Aβ è distribuito in tutta la corteccia e l’ippocampo dei topi APP/PS1. Tuttavia, a 6 mesi, i depositi di Aβ sono limitati alla corteccia e si osservano depositi minimi nell’ippocampo12. In tali condizioni, l’analisi dell’intera regione di interesse può essere l’approccio desiderato per aumentare l’area di campionamento dei tessuti e quindi il segnale Aβ. D’altra parte, l’analisi della sottoregione può essere il metodo di scelta quando il carico di Aβ in una specifica regione del cervello è di interesse (ad esempio, la corteccia somatosensoriale). Inoltre, a 13 mesi, i topi maschi APP / PS1 mostrano intense macchie 6E10 positive e la colorazione immunofluorescente si traduce in un segnale eccellente con uno sfondo molto basso, rendendo l’attuale protocollo molto adatto per la quantificazione nelle condizioni date. Non è chiaro se questo metodo di quantificazione possa essere applicato con successo a colorazioni meno intense e sarà necessario un lavoro futuro per rispondere a questa domanda. Il metodo di quantificazione immunofluorescente e di immagine qui presentato rileva tutte le forme di Aβ, compresa la forma precursore13. Di conseguenza, se c’è un interesse per la rilevazione di una specifica specie di Aβ (ad esempio, Aβ1-40 o Aβ1-42), possono essere utilizzati anticorpi specifici per queste isoforme Aβ. Pertanto, sebbene il metodo di colorazione e rilevamento immunofluorescente 6E10 fosse correlato alle misurazioni delle misurazioni di Aβ1-42 in omogeneizzati dell’intero cervello utilizzando ELISA (Figura 5F, G), la correlazione era solo modesta. Ciò può essere attribuito alla misurazione di solo Aβ1-42 utilizzando l’ELISA e al rilevamento di tutte le specie Aβ utilizzando l’immunocolorazione 6E10. Il presente studio utilizza tre lettori per valutare l’accordo e la correlazione tra le analisi complete e sub-regionali. Avere lettori aggiuntivi può migliorare la robustezza dello studio e può convalidare ulteriormente gli accordi tra i due metodi qui presentati. Inoltre, usiamo la correlazione di Pearson come misura dell’accordo, che è ampiamente utilizzata tra gli altri metodi per descrivere l’accordo tra variabili continue19. Tuttavia, una limitazione dell’utilizzo della correlazione di Pearson per determinare l’accordo è che i due metodi utilizzati nel presente documento possono fornire risultati correlati, ma un metodo può comportare valori complessivamente più elevati rispetto all’altro a causa di distorsioni sistematiche. Pertanto, la correlazione di Pearson è una buona misura dell’accordo relativo19. Per aumentare la robustezza del protocollo, è possibile utilizzare metodi aggiuntivi per confermare l’accordo assoluto, come il confronto dell’area media 6E10-positiva con i due metodi (Figura 5E)19. Nel complesso, l’attuale protocollo confronta il carico di Aβ rilevato dalla colorazione immunofluorescente e analizza le regioni complete e secondarie di interesse nelle sezioni del tessuto cerebrale. I risultati mostrano una forte correlazione tra questi due metodi per le sezioni di tessuto cerebrale derivate da topi maschi APP / PS1 di 13 mesi che mostrano abbondanti depositi di Aβ.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata supportata dal National Institute of Aging del National Institutes of Health con i numeri di premio R01AG062840 (a RKS) e R01AG072896 (a RKS). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali del National Institutes of Health. Circa $ 200k (100%) di fondi federali hanno sostenuto questo progetto. Vorremmo anche ringraziare il Dr. Joshua Yang per la sua assistenza con l’editing dei manoscritti.
Materials
| 15 mL conical tubes | ThermoFisher Scientific, MA, USA | 339650 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| 24-well plates | Fisher Scientific, NH, USA | FB012929 | https://www.fishersci.com/shop/products/jet-biofil-surface-treated-steriletissue-culture-plates-3/FB012929 |
| Amyloid beta 42 human ELISA kit | ThermoFisher Scientific, MA, USA | KHB3441 | https://www.thermofisher.com/elisa/product/Amyloid-beta-42-Human-ELISA-Kit/KHB3441 |
| Aqueous mounting media | Vector laboratories, CA, USA | H-5501-60 | https://vectorlabs.com/products/mounting/vectamount-aq-aqueous-mounting-medium |
| Bovine serum albumin | Sigmaaldrich, MO, USA | A2153-50G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/a2153?gclid=CjwKCAjw9aiIBhA1EiwAJ_G TSiZ9B3YGz3RvSpWqCH4CPW78 Dj4WlgxmzPs631z5IHmy5XLV TdC_jBoC9zQQAvD_BwE |
| BZ-X710 Keyence all-in-one fluorescence microscope | Keyence, IL, USA | BZ-X710 | https://www.keyence.com/products/microscope/fluorescence-microscope/bz-x700/models/bz-x710/ |
| Clear nail poilsh | User preference | NA | None |
| Cryostat | Leica Biosystems, IL, USA | Leica CM1860 Cryostat | https://www.leicabiosystems.com/us/histology-equipment/cryostats/leica-cm1860/ |
| Formic acid | Sigmaaldrich, MO, USA | F0507-500ML | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigald/f0507?gclid=CjwKCAjw9aiIBhA1EiwAJ_G TSheH6JMGnla50C3Ag0cLzXE8 BObxvDApl0udjYAPZmBGe7a 8PRUv1RoCt34QAvD_BwE |
| Glass coverslips | VWR, PA, USA | 48393-081 | https://us.vwr.com/store/product/4645817/vwr-micro-cover-glasses-rectangular |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, CA, USA | Version 8 | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
| ImageJ 1.51k | National Institutes of Health, MD, USA | Version 1.53e | https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| Mice | Jackson Laboratories, ME, USA | 034829-JAX | https://www.mmrrc.org/catalog/sds.php?mmrrc_id=34829 |
| Paraformaldehyde | Sigmaaldrich, MO, USA | P6148-500G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sial/p6148?gclid=CjwKCAjw9aiIBhA1EiwAJ_G TShtLb9Ax9MmRyrFn6Rfmmg 1l52_5XZFXOeXT24ik8Lkw GH7fvlDoHBoChzYQAvD_BwE |
| Phenytoin/pentobarbital based anesthetic (Euthasol) | Patterson Veterinary, MA, USA | 07-805-9296 | https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_32818 |
| Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific, NH, USA | BP661-50 | https://www.fishersci.com/shop/products/pbs-1x-powder-concentrate-white-granular-powder-fisher-bioreagents-2/BP66150 |
| Plus (+) microscope slides | Ted Pella, Inc., CA, USA | 260100 | https://www.tedpella.com/histo_html/slides.htm#260384 |
| Primary antibody (6E10) | Biolegend, CA, USA | 803013 | https://www.biolegend.com/en-us/products/alexa-fluor-488-anti-beta-amyloid-1-16-antibody-10833 |
| Sucrose | Sigmaaldrich, MO, USA | 47289 | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/supelco/47289?gclid=CjwKCAjw9aiIBhA1EiwAJ_ GTSuwlymWL_PUl2KIMHymi GLOWluZdPjf3pRcjMEjQD siItfWiG-C2-RoCxyoQAvD_BwE |
| Triton X 100 | Sigmaaldrich, MO, USA | T8787-100ML | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8787?context=product |
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