マウス脳切片におけるアミロイドβ負荷の完全領域対小領域定量化
Summary
本プロトコールは、アルツハイマー病のAPP/PS1トランスジェニックマウスモデルにおけるアミロイドβ負荷を定量するために、矢状マウス脳切片の全領域またはサブ領域の関心分析を実行する手順を記載および比較する。
Abstract
アミロイドβ(Aβ)プラークの細胞外蓄積は、アルツハイマー病(AD)の主要な病理学的特徴の1つであり、ADに対する唯一のFDA承認疾患修飾治療の標的である。 したがって、アミロイド前駆体タンパク質を過剰発現し、それによって脳Aβプラークを蓄積するトランスジェニックマウスモデルの使用は、マウスにおけるヒトADをモデル化するために広く使用されている。したがって、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)および免疫染色を含む免疫アッセイは、一般に、ADトランスジェニックマウスに由来する脳組織におけるAβ負荷を測定する。Aβの検出および定量のための方法は十分に確立され、文書化されているが、脳組織において選択された関心領域のサイズが免疫染色後のAβ負荷測定に及ぼす影響は報告されていない。したがって、現在のプロトコルは、画像解析ソフトウェアを使用して、関心の全領域およびサブ領域にわたるAβ負荷測定値を比較することを目的としていました。脳組織調製、自由浮遊脳切片免疫染色、イメージング、および関心の完全領域対サブ領域におけるAβ負荷の定量化に関与するステップは、生後13ヶ月のAPP/PS1二重トランスジェニック雄マウスに由来する脳切片を用いて記載されている。現在のプロトコルと結果は、Aβ陽性領域の定量に対する関心領域の大きさの影響に関する貴重な情報を提供し、広範なAβ沈着を示す生後13ヶ月の雄APP/PS1マウス由来の脳切片の完全およびサブ関心領域分析を用いて得られたAβ陽性領域間に強い相関関係を示す。
Introduction
アルツハイマー病(AD)は、米国における死因の第6位であり、公衆衛生上の脅威であり続けており、推定620万人のアメリカ人がADとともに暮らしています。これは2060年までに1380万人に達すると予想されています1。今日まで、コリンエステラーゼ阻害剤やメマンチンなどの薬物療法による対症療法は、治療の主な経過です2。ADは、アミロイドβ(Aβ)プラークの細胞外沈着および神経原線維もつれの形態での細胞内過リン酸化タウ蓄積などの神経病理学的症状によって特徴付けられる3、4。β-およびγ-セクレターゼ を介した アミロイド前駆体タンパク質(APP)のタンパク質分解内切断によって形成されるAβ凝集体は、オリゴマーおよび線維を形成し、神経毒性作用5をもたらす。Aβは1980年代から主要な病理学的役割を果たすと仮説されており、AD6に対する唯一のFDA承認の疾患修飾療法の治療標的である。その結果、堅牢な脳Aβ蓄積をもたらす遺伝子に変異を有するトランスジェニックADマウスモデルは、1990年代初頭から前臨床AD研究に広く使用されてきた7。
これらのADトランスジェニックマウス脳におけるAβ種の検出は、一般に、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)および免疫染色の2つの免疫アッセイを用いて行われる。前者のアッセイは、異なるAβ種の定量的決定を可能にし、組織切片化、免疫染色、イメージング、および定量を含むいくつかの逐次組織処理およびイメージングステップを必要とする免疫染色と比較して、より少ない時間である8。また、免疫染色後に得られた結果は半定量的8である。しかし、Aβを空間的に局在化する能力により、免疫染色は脳組織におけるAβ検出のための魅力的なアプローチとなる8。
Aβ免疫染色を使用している間、いくつかの異なる定量パラダイムが異なる研究グループによって採用されてきた。例えば、関心のある領域全体(皮質または海馬)のAβ負荷を定量化する研究グループもあれば、関心のある特定のサブ領域(皮質または海馬の一部)のAβ負荷を定量化する研究グループもあります9,10,11。Aβの検出および定量のための方法は十分に確立され、文書化されているが、免疫染色後のAβ負荷測定に対する関心領域のサイズの影響は報告されていない。したがって、現在のプロトコルは、画像解析ソフトウェアImageJを使用して、関心の全領域とサブ領域にわたるAβ負荷測定値を比較することを目的としていました。
現在の研究では、キメラマウス/ヒトAPPと変異型プレセニリン1を発現する生後13ヶ月のAPP/PS1ダブルトランスジェニック雄マウスを使用して、AD12の早期発症をモデル化した。Aβ沈着物は6〜7ヶ月齢までに発達し始め、12〜9〜10ヶ月齢までにこれらのマウスの皮質および海馬の両方に豊富なAβ蓄積が観察される。トランスジェニックアミロイドペプチドおよびホロタンパク質は、6E10−免疫染色13によって検出することができ、本プロトコールにとって望ましい動物モデルとなる。本明細書でカバーされる手順は、脳組織調製、自由浮遊切片の免疫染色、画像化、および関心のある完全対サブ領域におけるAβ負荷の定量化を含む。この解析は、完全領域定量と亜局所定量の間に強い相関関係を示しており、豊富なAβ沈着を示す生後13ヶ月のAPP/PS1雄マウス由来の脳組織切片において、これら2つの方法の確固たる一致を示している。
Protocol
Representative Results
Discussion
本明細書に記載のプロトコールは、矢状切片化のための半脳調製、自由浮遊切片上の6E10抗体を用いたAβ沈着物の免疫蛍光染色、Aβ染色された脳切片の画像化、続いて画像解析ソフトウェアを用いたマウス脳組織の皮質および海馬におけるAβ沈着の定量化のための手順を概説する。脳組織切片8、10におけるAβ負荷を定量化するための公表されたプロトコルがあるが、このプロトコルは、皮質および海馬における関心のあるサブ領域におけるAβ負荷と比較して、アイソ皮質全体(皮質と呼ばれる)および海馬におけるAβ負荷の定量化に関与するステップを記載する。対象領域の完全領域とサブ領域の相関分析も提供されます。
プロトコルにはいくつかの重要なステップがあります。第1に、記載されるプロトコルは、厚さ20μmの脳組織切片に対して、自由浮遊免疫染色を施し、その結果、組織切片18内で最適な抗体浸透をもたらす。自由浮遊技術では、免疫蛍光染色中に組織切片を異なる溶液間で手動で移すこと、および手順全体を通して組織切片を慎重に取り扱うことが必要な場合があります。これは、現在のプロトコールで抗原検索のために組織切片を70%ギ酸溶液に浸漬し、薄切片の組織の脆弱性を高める場合に特に重要です。記載されたプロトコールに対する代替アプローチには、より厚い組織切片(例えば、30〜40μm)を使用すること、または免疫蛍光染色の前に正に荷電したスライドに直接取り付けられた組織切片を使用することが含まれる。第2に、本明細書に記載のプロトコールは、蛍光標識された6E10抗体を使用する。蛍光標識された6E10抗体を使用する以外に、非蛍光性の6E10抗体(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合6E10抗体)も、脳組織切片におけるAβ負荷を検出するために使用することができ、現在のプロトコールは、前述のように脳組織切片におけるAβ陽性免疫化学染色を定量するために適合させることができる8.第3に、Aβ負荷定量の結果の精度は、組織バックグラウンドおよびシグナル強度に依存する分析ソフトウェアにおける適切な閾値選択に依存するであろう。閾値選択は、Aβ陽性染色のみが定量のために選択されるように、エンドユーザーによって行われなければならない。しきい値設定の精度を保証するために、すべての画像に適用できる特定のしきい値を最適化するには、エンドユーザーの介入が必要です。第四に、サブ関心領域分析は、組織切片における小さな関心領域を選択する必要があるので、2つの独立したリーダがこの分析に使用された。データ収集中に独立性と盲目を維持するために、すべての画像は番号コード化されました。画像解析シーケンスは、異なる読者が任意の時点で異なる画像を分析するように、読者間でランダム化され、データは各週末に送信された。サブ関心領域分析における関心領域選択における読者間変動の可能性が高まるため、読者は、データ収集を開始する前に、皮質および海馬における領域選択を最適化するために、いくつかのサンプル画像を使用して訓練された。このトレーニングは、読者間のばらつきを減らすために不可欠であり、ご覧のとおり(図5A、B)、両方の読者によって報告された6E10陽性領域は、現在の研究において強い相対的一致を示しています。
現在のプロトコルと結果は、関心領域サイズがAβ陽性領域定量に与える影響に関する貴重な情報を提供します。より大きな関心領域は、より小さな関心領域よりも組織を表すことが期待される。したがって、組織中のAβ負荷を正確に定量するためには、より大きな組織をサンプリングすることが望ましい。しかしながら、組織内の均質なAβ負荷分布の場合、より小さいサンプリング領域は、一般に、分析中のより大きな組織の良好な表現であると考えられる。現在の研究結果はこれを確認し、皮質全体および海馬におけるAβ負荷は、皮質および海馬の選択されたサブ領域におけるAβ負荷の強い相関であった(図5C、D)。関心のある全領域とサブ領域の一致をさらに確認するために、皮質と海馬の平均6E10陽性領域を比較したところ、2つの方法の間に差は見られませんでした(図5E)。これは、これらの方法(全領域分析またはサブ領域分析)のいずれかが同等のAβ荷重測定値をもたらすことを裏付けています。
現在のプロトコルにはいくつかの制限があります。2 つの方法(全領域分析とサブ領域分析)は、必ずしも同じ意味で使用できるとは限りません。完全領域解析またはサブ領域解析を使用するかどうかは、ADマウスモデルの年齢、性別、および系統によって影響を受ける組織内のAβの局所分布に依存する。13ヶ月で、Aβ負荷はAPP/PS1マウスの皮質および海馬全体に分布する。しかし、6ヶ月で、Aβ沈着は皮質に限定され、海馬12では最小限の沈着が観察される。このような条件下で、完全関心領域分析は、組織サンプリング領域およびそれによってAβシグナルを増加させるための所望のアプローチであり得る。一方、サブ領域解析は、特定の脳領域(例えば、体性感覚皮質)におけるAβ負荷が対象である場合に選択される方法であり得る。さらに、13ヶ月で、APP/PS1雄マウスは強烈な6E10陽性染色を示し、免疫蛍光染色は非常に低いバックグラウンドで優れたシグナルをもたらし、現在のプロトコルは所定の条件下での定量に非常に適しています。この定量化法が強度の低い染色にうまく適用できるかどうかは不明であり、この質問に答えるためには将来の研究が必要になります。本明細書に提示される免疫蛍光および画像定量法は、前駆体形態13を含むすべての形態のAβを検出する。その結果、特定のAβ種(例えば、Aβ1-40またはAβ1-42)の検出に関心がある場合は、これらのAβアイソフォームに特異的な抗体を使用することができる。したがって、6E10免疫蛍光染色および検出方法は、ELISAを用いた全脳ホモジネート中のAβ1-42測定値の測定値と相関していたが(図5F,G)、相関はごくわずかであった。これは、ELISAを用いたAβ1-42のみの測定と、6E10免疫染色を用いた全Aβ種の検出に起因する可能性がある。現在の研究では、3人の読者を使用して、完全地域分析と準地域分析の間の一致と相関関係を評価しています。読者が増えることで、研究の堅牢性が向上し、ここで提示された2つの方法の間の合意をさらに検証することができます。さらに、我々は、連続変数19間の一致を記述するために他の方法の中でも広く使用されている一致の尺度としてピアソン相関を使用する。しかしながら、ピアソン相関を使用して一致を決定することの1つの制限は、本明細書で使用される2つの方法が関連する結果を提供し得るが、一方の方法は、系統的バイアスのために他方よりも全体的に高い値をもたらし得ることである。したがって、ピアソン相関は相対的一致19の良い尺度である。プロトコルのロバスト性を高めるために、絶対一致を確認するための追加の方法、例えば2つの方法による平均6E10陽性領域を比較するなど(図5E)、19を使用することができる。まとめると、現在のプロトコルは、免疫蛍光染色によって検出されたAβ負荷を比較し、脳組織切片の関心の完全領域およびサブ領域を分析する。この結果は、豊富なAβ沈着を示す生後13ヶ月のAPP/PS1雄マウス由来の脳組織切片について、これら2つの方法の間に強い相関関係を示した。
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この出版物で報告された研究は、受賞番号R01AG062840(RKS宛)およびR01AG072896(RKS宛)の国立衛生研究所の国立加齢研究所の支援を受けています。コンテンツは著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。連邦資金の約20万ドル(100%)がこのプロジェクトを支援した。また、原稿編集にご協力いただいたジョシュア・ヤン博士にも感謝申し上げます。
Materials
| 15 mL conical tubes | ThermoFisher Scientific, MA, USA | 339650 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| 24-well plates | Fisher Scientific, NH, USA | FB012929 | https://www.fishersci.com/shop/products/jet-biofil-surface-treated-steriletissue-culture-plates-3/FB012929 |
| Amyloid beta 42 human ELISA kit | ThermoFisher Scientific, MA, USA | KHB3441 | https://www.thermofisher.com/elisa/product/Amyloid-beta-42-Human-ELISA-Kit/KHB3441 |
| Aqueous mounting media | Vector laboratories, CA, USA | H-5501-60 | https://vectorlabs.com/products/mounting/vectamount-aq-aqueous-mounting-medium |
| Bovine serum albumin | Sigmaaldrich, MO, USA | A2153-50G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/a2153?gclid=CjwKCAjw9aiIBhA1EiwAJ_G TSiZ9B3YGz3RvSpWqCH4CPW78 Dj4WlgxmzPs631z5IHmy5XLV TdC_jBoC9zQQAvD_BwE |
| BZ-X710 Keyence all-in-one fluorescence microscope | Keyence, IL, USA | BZ-X710 | https://www.keyence.com/products/microscope/fluorescence-microscope/bz-x700/models/bz-x710/ |
| Clear nail poilsh | User preference | NA | None |
| Cryostat | Leica Biosystems, IL, USA | Leica CM1860 Cryostat | https://www.leicabiosystems.com/us/histology-equipment/cryostats/leica-cm1860/ |
| Formic acid | Sigmaaldrich, MO, USA | F0507-500ML | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigald/f0507?gclid=CjwKCAjw9aiIBhA1EiwAJ_G TSheH6JMGnla50C3Ag0cLzXE8 BObxvDApl0udjYAPZmBGe7a 8PRUv1RoCt34QAvD_BwE |
| Glass coverslips | VWR, PA, USA | 48393-081 | https://us.vwr.com/store/product/4645817/vwr-micro-cover-glasses-rectangular |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, CA, USA | Version 8 | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
| ImageJ 1.51k | National Institutes of Health, MD, USA | Version 1.53e | https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| Mice | Jackson Laboratories, ME, USA | 034829-JAX | https://www.mmrrc.org/catalog/sds.php?mmrrc_id=34829 |
| Paraformaldehyde | Sigmaaldrich, MO, USA | P6148-500G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sial/p6148?gclid=CjwKCAjw9aiIBhA1EiwAJ_G TShtLb9Ax9MmRyrFn6Rfmmg 1l52_5XZFXOeXT24ik8Lkw GH7fvlDoHBoChzYQAvD_BwE |
| Phenytoin/pentobarbital based anesthetic (Euthasol) | Patterson Veterinary, MA, USA | 07-805-9296 | https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_32818 |
| Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific, NH, USA | BP661-50 | https://www.fishersci.com/shop/products/pbs-1x-powder-concentrate-white-granular-powder-fisher-bioreagents-2/BP66150 |
| Plus (+) microscope slides | Ted Pella, Inc., CA, USA | 260100 | https://www.tedpella.com/histo_html/slides.htm#260384 |
| Primary antibody (6E10) | Biolegend, CA, USA | 803013 | https://www.biolegend.com/en-us/products/alexa-fluor-488-anti-beta-amyloid-1-16-antibody-10833 |
| Sucrose | Sigmaaldrich, MO, USA | 47289 | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/supelco/47289?gclid=CjwKCAjw9aiIBhA1EiwAJ_ GTSuwlymWL_PUl2KIMHymi GLOWluZdPjf3pRcjMEjQD siItfWiG-C2-RoCxyoQAvD_BwE |
| Triton X 100 | Sigmaaldrich, MO, USA | T8787-100ML | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8787?context=product |
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