Voll- versus subregionale Quantifizierung der Amyloid-Beta-Belastung von Hirnschnitten der Maus
Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt und vergleicht das Verfahren zur Durchführung einer Analyse der gesamten Region oder Subregion von Interesse an sagittalen Hirnschnitten der Maus zur Quantifizierung der Amyloid-Beta-Belastung im transgenen APP/PS1-Mausmodell der Alzheimer-Krankheit.
Abstract
Die extrazelluläre Akkumulation von Amyloid-Beta (Aβ)-Plaques ist eines der wichtigsten pathologischen Merkmale der Alzheimer-Krankheit (AD) und das Ziel der einzigen von der FDA zugelassenen krankheitsmodifizierenden Behandlung von AD. Dementsprechend wird die Verwendung von transgenen Mausmodellen, die das Amyloid-Vorläuferprotein überexprimieren und dadurch zerebrale Aβ-Plaques akkumulieren, häufig verwendet, um die menschliche AD bei Mäusen zu modellieren. Daher messen Immunoassays, einschließlich enzymgebundener Immunsorbentien-Assays (ELISA) und Immunfärbung, üblicherweise die Aβ-Last in Hirngeweben, die von transgenen AD-Mäusen stammen. Obwohl die Methoden für den Aβ-Nachweis und die Quantifizierung gut etabliert und dokumentiert sind, wurde der Einfluss der Größe der im Hirngewebe ausgewählten Region von Interesse auf Aβ-Lastmessungen nach Immunfärbung nicht berichtet. Daher zielte das aktuelle Protokoll darauf ab, die Aβ-Lastmessungen über die von Interesse befindlichen Voll- und Teilregionen mit einer Bildanalysesoftware zu vergleichen. Die Schritte bei der Vorbereitung des Hirngewebes, der Immunfärbung des frei schwebenden Hirnabschnitts, der Bildgebung und der Quantifizierung der Aβ-Last in Voll- und Subregionen von Interesse werden anhand von Hirnschnitten beschrieben, die von 13 Monate alten APP / PS1-Doppeltransgenen männlichen Mäusen abgeleitet wurden. Das aktuelle Protokoll und die Ergebnisse liefern wertvolle Informationen über den Einfluss der Größe der interessierenden Region auf die Aβ-positive Flächenquantifizierung und zeigen eine starke Korrelation zwischen der Aβ-positiven Fläche, die unter Verwendung der Voll- und Subregionen von Interessenanalysen für Hirnschnitte erhalten wurde, die von 13 Monate alten männlichen APP / PS1-Mäusen abgeleitet wurden, die eine weit verbreitete Aβ-Ablagerung zeigen.
Introduction
Die Alzheimer-Krankheit (AD), die sechsthäufigste Todesursache in den Vereinigten Staaten, ist nach wie vor eine Bedrohung für die öffentliche Gesundheit, wobei schätzungsweise 6,2 Millionen Amerikaner mit AD leben. Bis 2060 werden voraussichtlich 13,8 Millionen erreicht1. Bis heute ist die symptomatische Behandlung durch Medikamente wie Cholinesterasehemmer und Memantin der primäre Behandlungsverlauf2. AD ist gekennzeichnet durch neuropathologische Manifestationen wie extrazelluläre Ablagerung von Amyloid-beta (Aβ)-Plaques und intrazelluläre hyperphosphorylierte Tau-Akkumulation in Form von neurofibrillären Verwicklungen 3,4. Gebildet durch eine endoproteolytische Spaltung des Amyloid-Vorläuferproteins (APP) über Beta- und Gamma-Sekretase, aggregiert Aβ zu Oligomeren und Fibrillen, was zu neurotoxischen Wirkungenführt 5. Es wird angenommen, dass Aβ seit den 1980er Jahren eine primäre pathologische Rolle spielt und das therapeutische Ziel der einzigen von der FDA zugelassenen krankheitsmodifizierenden Therapie für AD6 ist. Infolgedessen werden transgene AD-Mausmodelle, die Mutationen in Genen beherbergen, die zu einer robusten zerebralen Aβ-Akkumulation führen, seit den frühen 1990er Jahren häufig für die präklinische AD-Forschung eingesetzt7.
Der Nachweis von Aβ-Spezies in diesen transgenen AD-Mausgehirnen erfolgt im Allgemeinen unter Verwendung von zwei Immunoassays: Enzym-linked Immunosorbent Assay (ELISA) und Immunfärbung. Der erste Assay ermöglicht die quantitative Bestimmung verschiedener Aβ-Spezies und ist im Vergleich zur Immunfärbung, die mehrere aufeinanderfolgende Gewebeverarbeitungs- und Bildgebungsschritte erfordert, einschließlich Gewebeschnitt, Immunfärbung, Bildgebung und Quantifizierung8. Darüber hinaus sind die Ergebnisse, die nach der Immunfärbung erzielt wurden, semi-quantitativ8. Die Fähigkeit, Aβ räumlich zu lokalisieren, macht die Immunfärbung jedoch zu einem attraktiven Ansatz für den Aβ-Nachweis im Hirngewebe8.
Bei der Verwendung der Aβ-Immunfärbung wurden verschiedene Quantifizierungsparadigmen von verschiedenen Forschungsgruppen eingesetzt. Zum Beispiel quantifizieren einige Forschungsgruppen die Aβ-Last in der gesamten interessierenden Region (Kortex oder Hippocampus), während andere die Aβ-Last in einer bestimmten Subregion von Interesse (einem Teil des Kortex oder des Hippocampus) quantifizieren9,10,11. Obwohl die Methoden für den Aβ-Nachweis und die Quantifizierung gut etabliert und dokumentiert sind, wurde der Einfluss der Größe der interessierenden Region auf Aβ-Belastungsmessungen nach Immunflecken nicht berichtet. Daher zielte das aktuelle Protokoll darauf ab, die Aβ-Lastmessungen über die Voll- und Unterregionen von Interesse mit einer Bildanalysesoftware, ImageJ, zu vergleichen.
Die aktuelle Studie verwendete 13 Monate alte APP / PS1-Doppeltransgene männliche Mäuse, die eine chimäre Maus / menschliche APP und ein mutiertes Presenilin 1 exprimieren, um den frühen Beginn von AD12 zu modellieren. Aβ-Ablagerungen beginnen sich im Alter von 6-7 Monaten zu entwickeln, und eine reichliche Aβ-Akkumulation wird sowohl im Kortex als auch im Hippocampus dieser Mäuse im Alter von 9-10 Monaten im Alter von12 Jahren beobachtet. Die transgenen Amyloidpeptide und das Holoprotein können durch 6E10-Immunfärbung13 nachgewiesen werden, was es zu einem wünschenswerten Tiermodell für das vorliegende Protokoll macht. Das hierin behandelte Verfahren umfasst die Vorbereitung des Hirngewebes, die Immunfärbung von frei schwebenden Abschnitten, die Bildgebung und die Quantifizierung der Aβ-Belastung in Voll- und Unterregionen von Interesse. Die Analyse zeigt eine starke Korrelation zwischen der voll- und subregionalen Quantifizierung, was auf eine robuste Übereinstimmung zwischen diesen beiden Methoden in den Hirngewebeabschnitten hinweist, die von 13 Monate alten männlichen APP / PS1-Mäusen stammen, die reichlich Aβ-Ablagerungen aufweisen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das hierin beschriebene Protokoll beschreibt das Verfahren zur Hemi-Hirn-Vorbereitung für die sagittale Schnitte, die immunfluoreszierende Färbung von Aβ-Ablagerungen unter Verwendung des 6E10-Antikörpers auf frei schwebenden Abschnitten, die Bildgebung der Aβ-gefärbten Hirnabschnitte gefolgt von der Quantifizierung der Aβ-Ablagerungen im Kortex und im Hippocampus des Hirngewebes der Maus mit einer Bildanalysesoftware. Während es veröffentlichte Protokolle zur Quantifizierung der Aβ-Last in Hirngewebeabschnitten 8,10 gibt, beschreibt dieses Protokoll die Schritte zur Quantifizierung der Aβ-Last im gesamten Isokortex (als Kortex bezeichnet) und Hippocampus im Vergleich zur Aβ-Last in einer Subregion von Interesse im Kortex und im Hippocampus, wenn dies gewünscht werden kann. Die Korrelation zwischen den Full- und Sub-Regions of Interest-Analysen wird ebenfalls bereitgestellt.
Das Protokoll enthält mehrere kritische Schritte. Erstens gilt das beschriebene Protokoll für 20 μm dicke Hirngewebeabschnitte, die einer frei schwebenden Immunfärbung unterzogen werden, was zu einer optimalen Antikörperpenetration innerhalb desGewebeabschnitts 18 führt. Die frei schwebende Technik kann erfordern, dass die Gewebeabschnitte während der Immunfluoreszenzfärbung manuell zwischen den verschiedenen Lösungen übertragen werden und die Gewebeabschnitte während des gesamten Verfahrens sorgfältig gehandhabt werden. Dies ist besonders wichtig, wenn die Gewebeabschnitte in die 70% ige Ameisensäurelösung für die Antigengewinnung im aktuellen Protokoll eingetaucht werden, wodurch die Gewebebrechlichkeit für dünne Abschnitte erhöht wird. Alternative Ansätze zum beschriebenen Protokoll umfassen die Verwendung dickerer Gewebeabschnitte (z. B. 30-40 μm) oder die Verwendung von Gewebeschnitten, die direkt auf positiv geladene Objektträger vor der Immunfluoreszenzfärbung montiert werden. Zweitens verwendet das hierin beschriebene Protokoll einen fluoreszierend markierten 6E10-Antikörper. Neben der Verwendung des fluoreszenzmarkierten 6E10-Antikörpers können nicht-fluoreszierende 6E10-Antikörper (z. B. Meerrettichperoxidase-konjugierter 6E10-Antikörper) auch zum Nachweis der Aβ-Belastung in Hirngewebeabschnitten verwendet werden, und das aktuelle Protokoll kann angepasst werden, um Aβ-positive immunchemische Färbungen in den Hirngewebeabschnitten zu quantifizieren, wie zuvor beschrieben8 . Drittens hängt die Genauigkeit der Ergebnisse für die Aβ-Lastquantifizierung von der geeigneten Schwellenwertauswahl in der Analysesoftware ab, die vom Gewebehintergrund und der Signalintensität abhängt. Die Auswahl des Schwellenwerts muss vom Endbenutzer so durchgeführt werden, dass nur Aβ-positive Flecken für die Quantifizierung ausgewählt werden. Ein Eingreifen des Endbenutzers ist erforderlich, um den spezifischen Schwellenwert zu optimieren, der auf alle Bilder angewendet werden kann, um die Genauigkeit der Schwellenwerteinstellung sicherzustellen. Viertens, da die Subregion of Interest-Analyse die Auswahl einer kleinen Region von Interesse im Gewebeabschnitt erfordert, wurden zwei unabhängige Leser für diese Analyse verwendet. Um die Unabhängigkeit und Verblendung während der Datenerfassung zu wahren, wurden alle Bilder nummerncodiert; Die Bildanalysesequenz wurde zwischen den Lesern randomisiert, so dass die verschiedenen Leser zu einem bestimmten Zeitpunkt verschiedene Bilder analysierten, und die Daten wurden am Ende jeder Woche eingereicht. Aufgrund der erhöhten Wahrscheinlichkeit einer Inter-Reader-Variabilität in der Auswahl der Interessenregion in der Subregion of Interest-Analyse wurden die Leser anhand mehrerer Stichprobenbilder geschult, um die Regionsauswahl im Kortex und im Hippocampus zu optimieren, bevor mit der Datenerhebung begonnen wurde. Dieses Training ist entscheidend, um die Variabilität zwischen den Lesern zu reduzieren, und wie man sehen kann (Abbildung 5A, B), zeigt der 6E10-positive Bereich, der von beiden Lesern berichtet wird, eine starke relative Übereinstimmung in der aktuellen Studie.
Das aktuelle Protokoll und die Ergebnisse liefern wertvolle Informationen über den Einfluss der interessierenden Region auf die Aβ-positive Flächenquantifizierung. Es wird erwartet, dass eine größere Region von Interesse das Gewebe mehr repräsentiert als eine kleinere Region von Interesse. Daher ist die Probenahme eines größeren Gewebes wünschenswert, um die Aβ-Belastung in Geweben genau zu quantifizieren. Im Falle einer homogenen Aβ-Lastverteilung innerhalb des Gewebes wird jedoch ein kleinerer Probenahmebereich im Allgemeinen als eine gute Darstellung des zu analysierenden größeren Gewebes angesehen. Die aktuellen Studienergebnisse bestätigen dies, und die Aβ-Last im gesamten Kortex und im Hippocampus war ein starkes Korrelat der Aβ-Last in einer ausgewählten Subregion des Kortex und des Hippocampus (Abbildung 5C, D). Um die Übereinstimmung zwischen den Voll- und Subregionen der Interessenanalysen weiter zu bestätigen, wurden die mittlere 6E10-positive Fläche im Kortex und im Hippocampus verglichen und kein Unterschied zwischen den beiden Methoden (Abbildung 5E) gefunden. Dies bestätigt, dass jede dieser Methoden (Voll- oder Subregionenanalyse) vergleichbare Aβ-Lastmessungen liefert.
Das aktuelle Protokoll hat einige Einschränkungen. Die beiden Methoden (Vollregionen- versus Subregionenanalyse) werden möglicherweise nicht immer austauschbar verwendet. Die Wahl der Voll- oder Subregionenanalyse hängt von der regionalen Verteilung von Aβ innerhalb des Gewebes ab, die durch Alter, Geschlecht und Stamm des AD-Mausmodells beeinflusst wird. Nach 13 Monaten verteilt sich die Aβ-Last über den Kortex und Hippocampus der APP/PS1-Mäuse. Nach 6 Monaten sind die Aβ-Ablagerungen jedoch auf den Kortex beschränkt, und im Hippocampus12 werden minimale Ablagerungen beobachtet. Unter solchen Bedingungen kann die Analyse der gesamten interessierenden Region der gewünschte Ansatz sein, um die Gewebeentnahmefläche und damit das Aβ-Signal zu vergrößern. Auf der anderen Seite kann die Subregionenanalyse die Methode der Wahl sein, wenn die Aβ-Last in einer bestimmten Gehirnregion von Interesse ist (z. B. der somatosensorische Kortex). Darüber hinaus zeigen die männlichen APP/PS1-Mäuse nach 13 Monaten intensive 6E10-positive Flecken, und die immunfluoreszierende Färbung führt zu einem hervorragenden Signal mit einem sehr niedrigen Hintergrund, wodurch das aktuelle Protokoll für die Quantifizierung unter den gegebenen Bedingungen sehr geeignet ist. Es ist unklar, ob diese Quantifizierungsmethode erfolgreich auf weniger intensive Färbungen angewendet werden kann, und zukünftige Arbeiten werden erforderlich sein, um diese Frage zu beantworten. Das hierin vorgestellte Immunfluoreszenz- und Bildquantifizierungsverfahren detektiert alle Formen von Aβ, einschließlich der Vorläuferform13. Wenn also ein Interesse am Nachweis einer bestimmten Aβ-Spezies besteht (z. B. Aβ1-40 oder Aβ1-42), können Antikörper verwendet werden, die für diese Aβ-Isoformen spezifisch sind. Obwohl die 6E10-Immunfluoreszenzfärbungs- und Detektionsmethode mit den Messungen von Aβ1-42-Messungen in Ganzhirnhomogenaten unter Verwendung von ELISA korrelierte (Abbildung 5F, G), war die Korrelation daher nur bescheiden. Dies ist auf die Messung von nur Aβ1-42 mit dem ELISA und den Nachweis aller Aβ-Spezies mit der 6E10-Immunfärbung zurückzuführen. Die aktuelle Studie verwendet drei Leser, um die Übereinstimmung und Korrelation zwischen den voll- und subregionalen Analysen zu bewerten. Zusätzliche Leser können die Robustheit der Studie verbessern und die Vereinbarungen zwischen den beiden hier vorgestellten Methoden weiter validieren. Darüber hinaus verwenden wir die Pearson-Korrelation als Maß für die Übereinstimmung, die unter anderen Methoden häufig verwendet wird, um die Übereinstimmung zwischen kontinuierlichen Variablen19 zu beschreiben. Eine Einschränkung der Verwendung der Pearson-Korrelation zur Bestimmung der Übereinstimmung besteht jedoch darin, dass die beiden hierin verwendeten Methoden verwandte Ergebnisse liefern können, aber eine Methode kann aufgrund systematischer Verzerrung zu insgesamt höheren Werten führen als die andere. Daher ist die Pearson-Korrelation ein gutes Maß für die relative Übereinstimmung19. Um die Robustheit des Protokolls zu erhöhen, können zusätzliche Methoden zur Bestätigung der absoluten Übereinstimmung, wie der Vergleich der mittleren 6E10-positiven Fläche mit den beiden Methoden (Abbildung 5E), verwendetwerden 19. Zusammengenommen vergleicht das aktuelle Protokoll die durch Immunfluoreszenzfärbung nachgewiesene Aβ-Last und analysiert die Voll- und Subregionen, die in Hirngewebeschnitten von Interesse sind. Die Ergebnisse zeigen eine starke Korrelation zwischen diesen beiden Methoden für Hirngewebeschnitte, die von 13 Monate alten männlichen APP/PS1-Mäusen stammen, die reichlich Aβ-Ablagerungen aufweisen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die in dieser Veröffentlichung berichtete Forschung wurde vom National Institute of Aging der National Institutes of Health unter den Preisnummern R01AG062840 (zu RKS) und R01AG072896 (zu RKS) unterstützt. Der Inhalt liegt ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt die offiziellen Ansichten der National Institutes of Health dar. Ungefähr $ 200k (100%) der Bundesmittel unterstützten dieses Projekt. Wir möchten uns auch bei Dr. Joshua Yang für seine Unterstützung bei der Manuskriptbearbeitung bedanken.
Materials
| 15 mL conical tubes | ThermoFisher Scientific, MA, USA | 339650 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| 24-well plates | Fisher Scientific, NH, USA | FB012929 | https://www.fishersci.com/shop/products/jet-biofil-surface-treated-steriletissue-culture-plates-3/FB012929 |
| Amyloid beta 42 human ELISA kit | ThermoFisher Scientific, MA, USA | KHB3441 | https://www.thermofisher.com/elisa/product/Amyloid-beta-42-Human-ELISA-Kit/KHB3441 |
| Aqueous mounting media | Vector laboratories, CA, USA | H-5501-60 | https://vectorlabs.com/products/mounting/vectamount-aq-aqueous-mounting-medium |
| Bovine serum albumin | Sigmaaldrich, MO, USA | A2153-50G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/a2153?gclid=CjwKCAjw9aiIBhA1EiwAJ_G TSiZ9B3YGz3RvSpWqCH4CPW78 Dj4WlgxmzPs631z5IHmy5XLV TdC_jBoC9zQQAvD_BwE |
| BZ-X710 Keyence all-in-one fluorescence microscope | Keyence, IL, USA | BZ-X710 | https://www.keyence.com/products/microscope/fluorescence-microscope/bz-x700/models/bz-x710/ |
| Clear nail poilsh | User preference | NA | None |
| Cryostat | Leica Biosystems, IL, USA | Leica CM1860 Cryostat | https://www.leicabiosystems.com/us/histology-equipment/cryostats/leica-cm1860/ |
| Formic acid | Sigmaaldrich, MO, USA | F0507-500ML | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigald/f0507?gclid=CjwKCAjw9aiIBhA1EiwAJ_G TSheH6JMGnla50C3Ag0cLzXE8 BObxvDApl0udjYAPZmBGe7a 8PRUv1RoCt34QAvD_BwE |
| Glass coverslips | VWR, PA, USA | 48393-081 | https://us.vwr.com/store/product/4645817/vwr-micro-cover-glasses-rectangular |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, CA, USA | Version 8 | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
| ImageJ 1.51k | National Institutes of Health, MD, USA | Version 1.53e | https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| Mice | Jackson Laboratories, ME, USA | 034829-JAX | https://www.mmrrc.org/catalog/sds.php?mmrrc_id=34829 |
| Paraformaldehyde | Sigmaaldrich, MO, USA | P6148-500G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sial/p6148?gclid=CjwKCAjw9aiIBhA1EiwAJ_G TShtLb9Ax9MmRyrFn6Rfmmg 1l52_5XZFXOeXT24ik8Lkw GH7fvlDoHBoChzYQAvD_BwE |
| Phenytoin/pentobarbital based anesthetic (Euthasol) | Patterson Veterinary, MA, USA | 07-805-9296 | https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_32818 |
| Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific, NH, USA | BP661-50 | https://www.fishersci.com/shop/products/pbs-1x-powder-concentrate-white-granular-powder-fisher-bioreagents-2/BP66150 |
| Plus (+) microscope slides | Ted Pella, Inc., CA, USA | 260100 | https://www.tedpella.com/histo_html/slides.htm#260384 |
| Primary antibody (6E10) | Biolegend, CA, USA | 803013 | https://www.biolegend.com/en-us/products/alexa-fluor-488-anti-beta-amyloid-1-16-antibody-10833 |
| Sucrose | Sigmaaldrich, MO, USA | 47289 | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/supelco/47289?gclid=CjwKCAjw9aiIBhA1EiwAJ_ GTSuwlymWL_PUl2KIMHymi GLOWluZdPjf3pRcjMEjQD siItfWiG-C2-RoCxyoQAvD_BwE |
| Triton X 100 | Sigmaaldrich, MO, USA | T8787-100ML | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8787?context=product |
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