Volledige versus subregionale kwantificering van amyloïde-bètabelasting op hersensecties van muizen
Summary
Het huidige protocol beschrijft en vergelijkt de procedure om een volledige regio of subregio van belang analyse uit te voeren van sagittale muishersensecties om amyloïde-bètabelasting te kwantificeren in het APP / PS1 transgene muismodel van de ziekte van Alzheimer.
Abstract
Extracellulaire accumulatie van amyloïde-bèta (Aβ) plaques is een van de belangrijkste pathologische kenmerken van de ziekte van Alzheimer (AD) en is het doelwit van de enige door de FDA goedgekeurde ziektemodificerende behandeling voor AD. Dienovereenkomstig wordt het gebruik van transgene muismodellen die het amyloïde precursoreiwit overexpresseren en daardoor cerebrale Aβ-plaques accumuleren, veel gebruikt om menselijke AD bij muizen te modelleren. Daarom meten immunoassays, waaronder enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) en immunostaining, vaak de Aβ-belasting in hersenweefsels afgeleid van AD-transgene muizen. Hoewel de methoden voor Aβ-detectie en -kwantificering goed zijn vastgesteld en gedocumenteerd, is de impact van de grootte van het in het hersenweefsel geselecteerde interessegebied op Aβ-belastingsmetingen na immunostaining niet gemeld. Daarom was het huidige protocol gericht op het vergelijken van de Aβ-belastingsmetingen over de volledige en subregio’s van belang met behulp van een beeldanalysesoftware. De stappen die betrokken zijn bij de voorbereiding van hersenweefsel, vrij zwevende hersensectie immunostaining, beeldvorming en kwantificering van Aβ-belasting in volledige versus subregio’s van belang worden beschreven met behulp van hersensecties die zijn afgeleid van 13 maanden oude APP / PS1 dubbele transgene mannelijke muizen. Het huidige protocol en de resultaten bieden waardevolle informatie over de impact van de grootte van het interessegebied op de kwantificering van het Aβ-positieve gebied en tonen een sterke correlatie tussen het Aβ-positieve gebied dat is verkregen met behulp van de volledige en subregio’s van belanganalyses voor hersensecties afgeleid van 13 maanden oude mannelijke APP / PS1-muizen die wijdverspreide Aβ-afzetting vertonen.
Introduction
De ziekte van Alzheimer (AD), de zesde belangrijkste doodsoorzaak in de Verenigde Staten, blijft een bedreiging voor de volksgezondheid, met naar schatting 6,2 miljoen Amerikanen die leven met AD. Dit zal naar verwachting in 2060 13,8 miljoen bedragen1. Tot op heden is symptomatische behandeling door middel van medicijnen zoals cholinesteraseremmers en memantine de primairebehandelingskuur 2. AD wordt gekenmerkt door neuropathologische manifestaties zoals extracellulaire afzetting van amyloïde-bèta (Aβ) plaques en intracellulaire hyperfosforyleerde tau-accumulatie in de vorm van neurofibrillaire klitten 3,4. Gevormd door een endoproteolytische splitsing van het amyloïde precursoreiwit (APP) via bèta- en gamma-secretase, aggregeert Aβ om oligomeren en fibrillen te vormen, wat leidt tot neurotoxische effecten5. Aβ is verondersteld een primaire pathologische rol te vervullen sinds de jaren 1980, en is het therapeutische doelwit van de enige door de FDA goedgekeurde ziektemodificerende therapie voor AD6. Als gevolg hiervan zijn transgene AD-muismodellen met mutaties in genen die resulteren in robuuste cerebrale Aβ-accumulatie op grote schaal gebruikt voor preklinisch AD-onderzoek sinds de vroege jaren 19907.
Detectie van Aβ-soorten in deze AD-transgene muizenhersenen gebeurt over het algemeen met behulp van twee immunoassays: enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) en immunostaining. De eerste test maakt kwantitatieve bepaling van verschillende Aβ-soorten mogelijk en is minder tijdrovend in vergelijking met immunostaining, waarvoor verschillende sequentiële weefselverwerkings- en beeldvormingsstappen nodig zijn, waaronder weefselsectie, immunostaining, beeldvorming en kwantificering8. Verder zijn de resultaten verkregen na immunostaining semi-kwantitatief8. Het vermogen om Aβ ruimtelijk te lokaliseren maakt immunostaining echter een aantrekkelijke benadering voor Aβ-detectie in hersenweefsels8.
Tijdens het gebruik van Aβ-immunostaining zijn verschillende kwantificeringsparadigma’s gebruikt door verschillende onderzoeksgroepen. Sommige onderzoeksgroepen kwantificeren bijvoorbeeld de Aβ-belasting in het hele interessegebied (cortex of hippocampus), terwijl anderen de Aβ-belasting kwantificeren in een bepaald subgebied van belang (een deel van de cortex of de hippocampus)9,10,11. Hoewel de methoden voor Aβ-detectie en -kwantificering goed zijn vastgesteld en gedocumenteerd, is de impact van de omvang van het interessegebied op Aβ-belastingsmetingen na immunostaining niet gerapporteerd. Daarom was het huidige protocol gericht op het vergelijken van de Aβ-belastingsmetingen in de volledige en subregio’s van belang met behulp van een beeldanalysesoftware, ImageJ.
De huidige studie gebruikte 13 maanden oude APP / PS1 dubbele transgene mannelijke muizen, die een chimere muis / menselijke APP en een gemuteerd preseniline 1 uitdrukken, om het vroege begin van AD12 te modelleren. Aβ-afzettingen beginnen zich te ontwikkelen op de leeftijd van 6-7 maanden en overvloedige Aβ-accumulatie wordt waargenomen, zowel in de cortex als in de hippocampus van deze muizen op de leeftijd van 9-10 maandenop de leeftijd van 12. De transgene amyloïde peptiden en holoproteïne kunnen worden gedetecteerd door 6E10-immunostaining13, waardoor het een wenselijk diermodel is voor het huidige protocol. De procedure die hierin wordt behandeld, omvat hersenweefselvoorbereiding, immunostaining van vrij zwevende secties, beeldvorming en kwantificering van Aβ-belasting in volledige versus subregio’s van belang. De analyse toont een sterke correlatie tussen de volledige en subregionale kwantificering, wat wijst op een robuuste overeenkomst tussen deze twee methoden in de hersenweefselsecties afgeleid van 13 maanden oude APP / PS1 mannelijke muizen die overvloedige Aβ-afzettingen vertonen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het hierin beschreven protocol schetst de procedure voor hemi-hersenvoorbereiding voor sagittale secties, immunofluorescente kleuring van Aβ-afzettingen met behulp van het 6E10-antilichaam op vrij zwevende secties, beeldvorming van de Aβ-gekleurde hersensecties gevolgd door kwantificering van de Aβ-afzettingen in de cortex en de hippocampus van hersenweefsel van muizen met behulp van een beeldanalysesoftware. Hoewel er gepubliceerde protocollen zijn om Aβ-belasting te kwantificeren in hersenweefselsecties 8,10, beschrijft dit protocol de stappen die betrokken zijn bij de kwantificering van Aβ-belasting in de gehele iso-cortex (aangeduid als cortex) en hippocampus in vergelijking met de Aβ-belasting in een subregio van belang in de cortex en de hippocampus, wanneer dit gewenst kan zijn. De correlatie tussen de volledige versus subregio’s van belanganalyses wordt ook gegeven.
Er zijn verschillende kritieke stappen in het protocol. Ten eerste is het beschreven protocol voor 20 μm dikke hersenweefselsecties onderworpen aan vrij zwevende immunostaining, wat resulteert in optimale antilichaampenetratie in de weefselsectie18. De vrij zwevende techniek kan vereisen dat de weefselsecties handmatig worden overgedragen tussen de verschillende oplossingen tijdens de immunofluorescente kleuring en zorgvuldige behandeling van de weefselsecties gedurende de hele procedure. Dit is vooral cruciaal wanneer de weefselsecties worden ondergedompeld in de 70% mierenzuuroplossing voor het ophalen van antigeen in het huidige protocol, waardoor de kwetsbaarheid van het weefsel voor dunne secties toeneemt. Alternatieve benaderingen van het beschreven protocol omvatten het gebruik van dikkere weefselsecties (bijv. 30-40 μm) of het gebruik van weefselsecties die direct op positief geladen dia’s zijn gemonteerd vóór de immunofluorescente kleuring. Ten tweede maakt het hierin beschreven protocol gebruik van een fluorescerend gelabeld 6E10-antilichaam. Naast het gebruik van het fluorescerend gelabelde 6E10-antilichaam, kunnen niet-fluorescerende 6E10-antilichamen (bijv. Mierikswortelperoxidase-geconjugeerd 6E10-antilichaam) ook worden gebruikt om Aβ-belasting in hersenweefselsecties te detecteren, en het huidige protocol kan worden aangepast om Aβ-positieve immunochemische vlekken in de hersenweefselsecties te kwantificeren zoals eerder beschreven8 . Ten derde zal de nauwkeurigheid van de resultaten voor Aβ-belastingkwantificering afhangen van de juiste drempelselectie in de analysesoftware, die afhankelijk is van de weefselachtergrond en signaalintensiteit. De drempelwaarde moet door de eindgebruiker zodanig worden geselecteerd dat alleen Aβ-positieve vlekken worden geselecteerd voor kwantificering. Tussenkomst van de eindgebruiker is vereist om de specifieke drempel te optimaliseren die op alle afbeeldingen kan worden toegepast om de nauwkeurigheid van de drempelinstelling te garanderen. Ten vierde, aangezien de subregio van interesseanalyse vereist dat een klein gebied van belang in de weefselsectie wordt geselecteerd, werden twee onafhankelijke lezers gebruikt voor deze analyse. Om de onafhankelijkheid en verblinding tijdens het verzamelen van gegevens te behouden, werden alle afbeeldingen gecodeerd met een nummer; de beeldanalysevolgorde werd gerandomiseerd tussen de lezers, zodat de verschillende lezers op elk moment verschillende afbeeldingen analyseerden en de gegevens aan het einde van elke week werden ingediend. Vanwege de verhoogde kans op inter-reader variabiliteit in het gebied van interesseselectie in de subregio van interesseanalyse, werden de lezers getraind met behulp van verschillende voorbeeldafbeeldingen om de regioselectie in de cortex en de hippocampus te optimaliseren voordat ze met de gegevensverzameling begonnen. Deze training is cruciaal om de variabiliteit tussen lezers te verminderen, en zoals te zien is (figuur 5A, B), vertoont het 6E10-positieve gebied dat door beide lezers wordt gerapporteerd een sterke relatieve overeenstemming in de huidige studie.
Het huidige protocol en de resultaten bieden waardevolle informatie over de impact van de regio van belang op de kwantificering van Aβ-positieve gebieden. Van een groter interessegebied wordt verwacht dat het het weefsel meer vertegenwoordigt dan een kleiner interessegebied. Daarom is het bemonsteren van een groter weefsel wenselijk om de Aβ-belasting in weefsels nauwkeurig te kwantificeren. In het geval van homogene Aβ-belastingsverdeling in het weefsel wordt een kleiner bemonsteringsgebied echter over het algemeen beschouwd als een goede weergave van het grotere weefsel dat wordt geanalyseerd. De huidige studieresultaten bevestigen dit, en de Aβ-belasting in de gehele cortex en de hippocampus was een sterke correlatie van Aβ-belasting in een geselecteerd subgebied van de cortex en de hippocampus (figuur 5C,D). Om de overeenkomst tussen de volledige en subregio’s van belanganalyses verder te bevestigen, werd het gemiddelde 6E10-positieve gebied in de cortex en de hippocampus vergeleken en werd geen verschil tussen de twee methoden (figuur 5E) gevonden. Dit bevestigt dat een van deze methoden (volledige of subregio-analyse) vergelijkbare Aβ-belastingsmetingen oplevert.
Het huidige protocol heeft enkele beperkingen. De twee methoden (volledige regio versus subregioanalyse) worden mogelijk niet altijd door elkaar gebruikt. De keuze om de volledige of subregio-analyse te gebruiken, hangt af van de regionale verdeling van Aβ in het weefsel, die wordt beïnvloed door de leeftijd, het geslacht en de stam van het AD-muismodel. Na 13 maanden wordt de Aβ-belasting verdeeld over de cortex en hippocampus van de APP/PS1-muizen. Na 6 maanden zijn Aβ-afzettingen echter beperkt tot de cortex en worden minimale afzettingen waargenomen in de hippocampus12. Onder dergelijke omstandigheden kan de analyse van het volledige interessegebied de gewenste aanpak zijn om het weefselbemonsteringsgebied en daarmee het Aβ-signaal te vergroten. Aan de andere kant kan subregio-analyse de voorkeursmethode zijn wanneer Aβ-belasting in een specifiek hersengebied van belang is (bijvoorbeeld de somatosensorische cortex). Bovendien vertonen de APP/PS1-mannetjesmuizen na 13 maanden intense 6E10-positieve vlekken en resulteert de immunofluorescente kleuring in een uitstekend signaal met een zeer lage achtergrond, waardoor het huidige protocol zeer geschikt is voor kwantificering onder de gegeven omstandigheden. Het is onduidelijk of deze kwantificeringsmethode met succes kan worden toegepast op minder intense kleuring, en toekomstig werk zal nodig zijn om deze vraag te beantwoorden. De hierin gepresenteerde immunofluorescentie- en beeldkwantificeringsmethode detecteert alle vormen van Aβ, inclusief de voorlopervorm13. Als gevolg hiervan, als er interesse is in de detectie van een specifieke Aβ-specie (bijvoorbeeld Aβ1-40 of Aβ1-42), kunnen antilichamen worden gebruikt die specifiek zijn voor deze Aβ-isovormen. Hoewel de 6E10 immunofluorescente kleurings- en detectiemethode correleerde met de metingen van Aβ1-42-metingen in homogenen van de hele hersenen met behulp van ELISA (figuur 5F, G), was de correlatie daarom slechts bescheiden. Dit kan worden toegeschreven aan de meting van alleen Aβ1-42 met behulp van de ELISA en detectie van alle Aβ-soorten met behulp van de 6E10 immunostaining. De huidige studie gebruikt drie lezers om de overeenkomst en correlatie tussen de volledige en subregionale analyses te beoordelen. Het hebben van extra lezers kan de robuustheid van de studie verbeteren en kan de overeenkomsten tussen de twee hier gepresenteerde methoden verder valideren. Verder gebruiken we de Pearson-correlatie als een maat voor overeenstemming, die veel wordt gebruikt naast andere methoden om de overeenkomst tussen continue variabelen te beschrijven19. Een beperking van het gebruik van de Pearson-correlatie om overeenstemming te bepalen, is echter dat de twee methoden die hierin worden gebruikt, gerelateerde resultaten kunnen opleveren, maar dat de ene methode kan resulteren in over het algemeen hogere waarden dan de andere als gevolg van systematische vertekening. Daarom is Pearson-correlatie een goede maat voor relatieve overeenstemming19. Om de robuustheid van het protocol te vergroten, kunnen aanvullende methodenworden gebruikt om de absolute overeenkomst te bevestigen, zoals het vergelijken van het gemiddelde 6E10-positieve gebied met de twee methoden (figuur 5E). Alles bij elkaar vergelijkt het huidige protocol de Aβ-belasting gedetecteerd door immunofluorescente kleuring en analyseert het de volledige en subregio’s van belang in hersenweefselsecties. De resultaten tonen een sterke correlatie tussen deze twee methoden voor hersenweefselsecties afgeleid van 13 maanden oude APP / PS1 mannelijke muizen die overvloedige Aβ-afzettingen vertonen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Onderzoek gerapporteerd in deze publicatie werd ondersteund door het National Institute of Aging van de National Institutes of Health onder toekenningsnummers R01AG062840 (naar RKS) en R01AG072896 (naar RKS). De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de National Institutes of Health. Ongeveer $ 200k (100%) van de federale fondsen ondersteunde dit project. We willen ook Dr. Joshua Yang bedanken voor zijn hulp bij het bewerken van manuscripten.
Materials
| 15 mL conical tubes | ThermoFisher Scientific, MA, USA | 339650 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| 24-well plates | Fisher Scientific, NH, USA | FB012929 | https://www.fishersci.com/shop/products/jet-biofil-surface-treated-steriletissue-culture-plates-3/FB012929 |
| Amyloid beta 42 human ELISA kit | ThermoFisher Scientific, MA, USA | KHB3441 | https://www.thermofisher.com/elisa/product/Amyloid-beta-42-Human-ELISA-Kit/KHB3441 |
| Aqueous mounting media | Vector laboratories, CA, USA | H-5501-60 | https://vectorlabs.com/products/mounting/vectamount-aq-aqueous-mounting-medium |
| Bovine serum albumin | Sigmaaldrich, MO, USA | A2153-50G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/a2153?gclid=CjwKCAjw9aiIBhA1EiwAJ_G TSiZ9B3YGz3RvSpWqCH4CPW78 Dj4WlgxmzPs631z5IHmy5XLV TdC_jBoC9zQQAvD_BwE |
| BZ-X710 Keyence all-in-one fluorescence microscope | Keyence, IL, USA | BZ-X710 | https://www.keyence.com/products/microscope/fluorescence-microscope/bz-x700/models/bz-x710/ |
| Clear nail poilsh | User preference | NA | None |
| Cryostat | Leica Biosystems, IL, USA | Leica CM1860 Cryostat | https://www.leicabiosystems.com/us/histology-equipment/cryostats/leica-cm1860/ |
| Formic acid | Sigmaaldrich, MO, USA | F0507-500ML | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigald/f0507?gclid=CjwKCAjw9aiIBhA1EiwAJ_G TSheH6JMGnla50C3Ag0cLzXE8 BObxvDApl0udjYAPZmBGe7a 8PRUv1RoCt34QAvD_BwE |
| Glass coverslips | VWR, PA, USA | 48393-081 | https://us.vwr.com/store/product/4645817/vwr-micro-cover-glasses-rectangular |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, CA, USA | Version 8 | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
| ImageJ 1.51k | National Institutes of Health, MD, USA | Version 1.53e | https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| Mice | Jackson Laboratories, ME, USA | 034829-JAX | https://www.mmrrc.org/catalog/sds.php?mmrrc_id=34829 |
| Paraformaldehyde | Sigmaaldrich, MO, USA | P6148-500G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sial/p6148?gclid=CjwKCAjw9aiIBhA1EiwAJ_G TShtLb9Ax9MmRyrFn6Rfmmg 1l52_5XZFXOeXT24ik8Lkw GH7fvlDoHBoChzYQAvD_BwE |
| Phenytoin/pentobarbital based anesthetic (Euthasol) | Patterson Veterinary, MA, USA | 07-805-9296 | https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_32818 |
| Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific, NH, USA | BP661-50 | https://www.fishersci.com/shop/products/pbs-1x-powder-concentrate-white-granular-powder-fisher-bioreagents-2/BP66150 |
| Plus (+) microscope slides | Ted Pella, Inc., CA, USA | 260100 | https://www.tedpella.com/histo_html/slides.htm#260384 |
| Primary antibody (6E10) | Biolegend, CA, USA | 803013 | https://www.biolegend.com/en-us/products/alexa-fluor-488-anti-beta-amyloid-1-16-antibody-10833 |
| Sucrose | Sigmaaldrich, MO, USA | 47289 | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/supelco/47289?gclid=CjwKCAjw9aiIBhA1EiwAJ_ GTSuwlymWL_PUl2KIMHymi GLOWluZdPjf3pRcjMEjQD siItfWiG-C2-RoCxyoQAvD_BwE |
| Triton X 100 | Sigmaaldrich, MO, USA | T8787-100ML | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8787?context=product |
References
- Alzheimer’s Association. 2021 Alzheimer’s disease facts and figures. Alzheimer’s & Dementia. 17 (3), 327-406 (2021).
- Langa, K. M., Foster, N. L., Larson, E. B. Mixed dementia: emerging concepts and therapeutic implications. Journal of the American Medical Association. 292 (23), 2901-2908 (2004).
- Gandy, S., DeKosky, S. T. Toward the treatment and prevention of Alzheimer’s disease: rational strategies and recent progress. Annual Review of Medicine. 64, 367-383 (2013).
- Bloom, G. S. Amyloid-beta and tau: the trigger and bullet in Alzheimer disease pathogenesis. JAMA Neurology. 71 (4), 505-508 (2014).
- Gremer, L., et al. Fibril structure of amyloid-beta(1-42) by cryo-electron microscopy. Science. 358 (6359), 116-119 (2017).
- Ferrero, J., et al. First-in-human, double-blind, placebo-controlled, single-dose escalation study of aducanumab (BIIB037) in mild-to-moderate Alzheimer’s disease. Alzheimer’s & Dementia Translational Research & Clinical Interventions. 2 (3), 169-176 (2016).
- Poon, C. H., Wang, Y., Fung, M. L., Zhang, C., Lim, L. W. Rodent models of amyloid-beta feature of Alzheimer’s disease: development and potential treatment implications. Aging and Disease. 11 (5), 1235-1259 (2020).
- Christensen, A., Pike, C. J. Staining and quantification of beta-amyloid pathology in transgenic mouse models of Alzheimer’s disease. Methods in Molecular Biology. 2144, 221 (2020).
- Thakker, D. R., et al. Intracerebroventricular amyloid-beta antibodies reduce cerebral amyloid angiopathy and associated micro-hemorrhages in aged Tg2576 mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (11), 4501-4506 (2009).
- Song, Z., et al. Detecting amyloid-beta accumulation via immunofluorescent staining in a mouse model of Alzheimer’s disease. Journal of Visualized Experiments. (170), e62254 (2021).
- Sun, J., et al. Hematologic safety of chronic brain-penetrating erythropoietin dosing in APP/PS1 mice. Alzheimer’s & DementiaTranslational Research & Clinical Interventions. 5, 627-636 (2019).
- Jankowsky, J. L., et al. Mutant presenilins specifically elevate the levels of the 42 residue beta-amyloid peptide in vivo: evidence for augmentation of a 42-specific gamma secretase. Human Molecular Genetics. 13 (2), 159-170 (2004).
- Grant, M. K. O., et al. Human cerebrospinal fluid 6E10-immunoreactive protein species contain amyloid precursor protein fragments. PloS One. 14 (2), 0212815 (2019).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Eichenbaum, K. D., et al. Minimally invasive method for murine brain fixation. Biotechniques. 39 (4), 487-490 (2005).
- Chang, R., et al. Blood-brain barrier penetrating biologic tnf-alpha inhibitor for Alzheimer’s disease. Molecular Pharmaceutics. 14 (7), 2340-2349 (2017).
- Pinskiy, V., et al. High-throughput method of whole-brain sectioning, using the tape-transfer technique. PloS One. 10 (7), 0102363 (2015).
- Potts, E. M., Coppotelli, G., Ross, J. M. Histological-based stainings using free-floating tissue sections. Journal of Visualized Experiments. (162), e61622 (2020).
- van Stralen, K. J., Dekker, F. W., Zoccali, C., Jager, K. J. Measuring agreement, more complicated than it seems. Nephron Clinical Practice. 120 (3), 162-167 (2012).
