Quantificação total versus sub-regional da carga amilóide-beta nas seções cerebrais do rato
Summary
O presente protocolo descreve e compara o procedimento para realizar uma análise de interesse de região completa ou sub-região de seções cerebrais de camundongos sagitos para quantificar a carga amilóide-beta no modelo de camundongo transgênico APP/PS1 da doença de Alzheimer.
Abstract
O acúmulo extracelular de placas amilóide-beta (Aβ) é uma das principais marcas patológicas da doença de Alzheimer (DA), e é o alvo do único tratamento modificador de doença aprovado pela FDA para AD. Consequentemente, o uso de modelos de camundongos transgênicos que superexpressam a proteína precursora amiloide e, assim, acumulam placas aβ cerebrais são amplamente utilizadas para modelar aD. Portanto, os imunoensatórios, incluindo o ensaio imunosorbente ligado à enzima (ELISA) e a imunostaining, geralmente medem a carga de Aβ em tecidos cerebrais derivados de camundongos transgênicos da DA. Embora os métodos de detecção e quantificação de Aβ tenham sido bem estabelecidos e documentados, o impacto do tamanho da região de interesse selecionado no tecido cerebral em medidas de carga Aβ após a imunostaining não foi relatado. Portanto, o protocolo atual visava comparar as medições de carga Aβ em todas as sub-regiões de interesse usando um software de análise de imagem. As etapas envolvidas na preparação do tecido cerebral, a imunostenção da seção cerebral flutuante livre, a imagem e a quantificação da carga de Aβ em total versus sub-regiões de interesse são descritas usando seções cerebrais derivadas de camundongos machos transgênicos duplos APP/PS1 de 13 meses de idade. O protocolo atual e os resultados fornecem informações valiosas sobre o impacto do tamanho da região de interesse na quantificação da área aβ positiva, e mostram uma forte correlação entre a área Aβ-positiva obtida utilizando-se as análises completas e sub-regiões de interesse para seções cerebrais derivadas de camundongos app/PS1 masculinos de 13 meses de idade que mostram uma deposição Aβ generalizada.
Introduction
A doença de Alzheimer (AD), a sexta principal causa de morte nos Estados Unidos, continua a ser uma ameaça à saúde pública, com cerca de 6,2 milhões de americanos vivendo com AD. Espera-se que chegue a 13,8 milhões até 20601. Até o momento, o manejo sintomático através de medicamentos como inibidores de colinestease e memantina é o curso primário do tratamento2. AD é caracterizada por manifestações neuropatologias como deposição extracelular de placas amilóide-beta (Aβ) e acúmulo de tau hiperfosforilato intracelular na forma de emaranhados neurofibrilares 3,4. Formado por um decote endoproteolítico da proteína precursora amiloide (APP) via beta e gama-secretase, a Aβ agrega para formar oligômeros e fibrilas, levando aos efeitos neurotóxicos5. Aβ tem sido hipótese para servir a um papel patológico primário desde a década de 1980, e é o alvo terapêutico da única terapia modificadora de doença aprovada pela FDA para AD6. Como resultado, modelos transgênicos de camundongos AD que abrigam mutações em genes que resultam em um acúmulo robusto de Aβ cerebral têm sido amplamente utilizados para pesquisas de AD pré-clínicos desde o início da década de 19907.
A detecção de espécies Aβ nestes cérebros de camundongos transgênicos da AD é geralmente feita usando dois imunoensatórios: ensaio imunosorbente ligado à enzima (ELISA) e imunostaining. O ensaio anterior permite a determinação quantitativa de diferentes espécies Aβ e é menos demorado em comparação com a imunostaining, que requer várias etapas sequenciais de processamento e imagem de tecido, incluindo seção de tecidos, imunostaining, imagem e quantificação8. Além disso, os resultados obtidos após a imunossuagem são semi-quantitativos8. No entanto, a capacidade de localizar espacialmente Aβ torna a imunostenção uma abordagem atraente para a detecção de Aβ em tecidos cerebrais8.
Ao usar a imunostaining Aβ, vários paradigmas de quantificação diferentes têm sido empregados por diferentes grupos de pesquisa. Por exemplo, alguns grupos de pesquisa quantificam a carga de Aβ em toda a região de interesse (córtex ou hipocampo), enquanto outros quantificam a carga Aβ em uma sub-região de interesse especificada (uma parte do córtex ou do hipocampo)9,10,11. Embora os métodos de detecção e quantificação de Aβ tenham sido bem estabelecidos e documentados, o impacto do tamanho da região de interesse nas medições de carga Aβ após a imunosstaining não foi relatado. Portanto, o protocolo atual visava comparar as medições de carga Aβ em todas as sub-regiões de interesse usando um software de análise de imagem, ImageJ.
O presente estudo utilizou camundongos machos transgênicos duplos APP/PS1 de 13 meses de idade, que expressam um mouse quimérico/APP humano e um mutante pré-sentimental 1, para modelar o início precoce do AD12. Os depósitos de Aβ começam a se desenvolver aos 6-7 meses de idade, e o acúmulo abundante de Aβ é observado tanto no córtex quanto no hipocampo desses camundongos por 9-10 meses de idade12. Os peptídeos amiloides transgênicos e a holoproteína podem ser detectados pelo 6E10-imunostaining13, tornando-se um modelo animal desejável para o presente protocolo. O procedimento aqui abordado inclui preparação de tecidos cerebrais, imunossaturação de seções flutuantes livres, imagem e quantificação da carga de Aβ em total versus sub-regiões de interesse. A análise mostra uma forte correlação entre a quantificação total e sub-regional, indicando concordância robusta entre esses dois métodos nas seções de tecido cerebral derivadas de camundongos machos APP/PS1 de 13 meses de idade que apresentam depósitos abundantes de Aβ.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo descrito aqui descreve o procedimento de preparação hemi-cérebro para secção sagital, coloração imunofluorescente de depósitos Aβ usando o anticorpo 6E10 em seções flutuantes livres, imagem das seções cerebrais manchadas de Aβ seguidas pela quantificação dos depósitos Aβ no córtex e no hipopótamo do tecido cerebral do rato usando um software de análise de imagem. Embora existam protocolos publicados para quantificar a carga de Aβ nas seções de tecido cerebral 8,10, este protocolo descreve as etapas envolvidas na quantificação da carga de Aβ em todo o iso-córtex (referido como córtex) e hipocampo em comparação com a carga Aβ em uma sub-região de interesse no córtex e no hipocampo, quando isso pode ser desejado. Também é fornecida a correlação entre as sub-regiões completas das análises de interesse.
Há vários passos críticos no protocolo. Primeiro, o protocolo descrito é para seções de tecido cerebral de 20 μm de espessura submetidas a imunostaining flutuante livre, o que resulta em penetração ideal de anticorpos dentro da seçãotecidual 18. A técnica de flutuação livre pode exigir que as seções teciduais sejam transferidas manualmente entre as diferentes soluções durante a coloração imunofluorescente e o manuseio cuidadoso das seções teciduais ao longo do procedimento. Isso é especialmente crucial quando as seções teciduais estão imersas na solução de ácido fórmico de 70% para recuperação de antígenos no protocolo atual, aumentando a fragilidade tecidual para seções finas. Abordagens alternativas ao protocolo descrito incluem o uso de seções de tecido mais grossas (por exemplo, 30-40 μm) ou o uso de seções teciduais que são diretamente montadas em lâminas carregadas positivamente antes da coloração imunofluorescente. Segundo, o protocolo descrito aqui usa um anticorpo 6E10 fluorescente. Além de usar o anticorpo 6E10 fluorescente, anticorpos não fluorescentes 6E10 (por exemplo, anticorpos 6E10 conjugados por rabanete) também podem ser usados para detectar carga de Aβ em seções de tecido cerebral, e o protocolo atual pode ser adaptado para quantificar manchas imunoquímicas aβ positivas nas seções do tecido cerebral como descrito anteriormente8 . Em terceiro lugar, a precisão dos resultados para quantificação da carga Aβ dependerá da seleção de limiares apropriada no software de análise, que depende do fundo do tecido e intensidade do sinal. A seleção de limiares deve ser realizada pelo usuário final, de tal forma que apenas as manchas Aβ-positivas sejam selecionadas para quantificação. A intervenção do usuário final é necessária para otimizar o limiar específico que pode ser aplicado a todas as imagens para garantir a precisão da configuração do limiar. Em quarto lugar, uma vez que a sub-região de análise de interesse requer a seleção de uma pequena região de interesse na seção de tecidos, dois leitores independentes foram utilizados para esta análise. Para manter a independência e a cegueira durante a coleta de dados, todas as imagens foram codificadas por números; a sequência de análise de imagens foi aleatória entre os leitores de modo que os diferentes leitores analisaram diferentes imagens a qualquer momento, e os dados foram enviados no final de cada semana. Devido à maior probabilidade de variabilidade entre leitores na região de seleção de interesse na sub-região de análise de interesse, os leitores foram treinados utilizando várias imagens de amostra para otimizar a seleção da região no córtex e no hipocampo antes de iniciar a coleta de dados. Esse treinamento é crucial para reduzir a variabilidade entre leitores e, como se pode ver (Figura 5A,B), a área 6E10-positiva relatada por ambos os leitores mostra uma forte concordância relativa no presente estudo.
O protocolo atual e os resultados fornecem informações valiosas sobre o impacto da região do tamanho dos juros na quantificação da área Aβ positiva. Espera-se que uma região maior de interesse represente o tecido mais do que uma região menor de interesse. Portanto, a amostragem de um tecido maior é desejável quantificar com precisão a carga Aβ nos tecidos. No entanto, no caso da distribuição homogênea da carga Aβ dentro do tecido, uma região amostral menor é geralmente considerada uma boa representação do tecido maior em análise. Os resultados atuais do estudo confirmam isso, e a carga de Aβ em todo o córtex e o hipocampo foi uma forte correlação da carga de Aβ em uma sub-região selecionada do córtex e do hipocampo (Figura 5C,D). Para confirmar ainda mais o acordo entre as análises de interesse completa e sub-regiões, foi comparada a área média 6E10 positiva no córtex e no hipocampo, não foi encontrada diferença entre os dois métodos (Figura 5E). Isso confirma que qualquer um desses métodos (análise completa ou sub-região) produz medições de carga Aβ comparáveis.
O protocolo atual tem algumas limitações. Os dois métodos (análise de região completa versus sub-região) nem sempre podem ser utilizados de forma intercambiável. A escolha do uso da análise completa ou sub-região dependerá da distribuição regional de Aβ dentro do tecido, que é impactado pela idade, sexo e tensão do modelo de camundongos AD. Aos 13 meses, a carga Aβ é distribuída por todo o córtex e hipocampo dos ratos APP/PS1. No entanto, aos 6 meses, os depósitos Aβ são limitados ao córtex, e depósitos mínimos são observados no hipocampo12. Sob tais condições, a região completa da análise de interesse pode ser a abordagem desejada para aumentar a área de amostragem de tecidos e, assim, o sinal Aβ. Por outro lado, a análise sub-região pode ser o método de escolha quando a carga de Aβ em uma região cerebral específica é de interesse, (por exemplo, o córtex somatosensorial). Além disso, aos 13 meses, os camundongos machos APP/PS1 demonstram intensas manchas 6E10 positivas, e a coloração imunofluorescente resulta em um excelente sinal com um fundo muito baixo, tornando o protocolo atual muito adequado para quantificação nas condições dadas. Não está claro se esse método de quantificação pode ser aplicado com sucesso a manchas menos intensas, e futuros trabalhos serão necessários para responder a essa pergunta. O método de quantificação imunofluorescente e de imagem aqui apresentado detecta todas as formas de Aβ, incluindo a forma precursora13. Como resultado, se houver interesse na detecção de uma espécie Aβ específica (por exemplo, Aβ1-40 ou Aβ1-42), anticorpos específicos desses isoformes Aβ podem ser usados. Portanto, embora o método de coloração e detecção imunofluorescente 6E10 tenha correlacionado com as medidas de Aβ1-42 em homogeneizadores cerebrais inteiros utilizando ELISA (Figura 5F,G), a correlação foi apenas modesta. Isso pode ser atribuído à medição de apenas Aβ1-42 usando o ELISA e detecção de todas as espécies Aβ usando a imunosstaining 6E10. O presente estudo utiliza três leitores para avaliar o acordo e a correlação entre as análises completa e sub-regional. Ter leitores adicionais pode melhorar a robustez do estudo e pode validar ainda mais os acordos entre os dois métodos aqui apresentados. Além disso, utilizamos a correlação de Pearson como medida de concordância, amplamente utilizada entre outros métodos para descrever a concordância entre as variáveis contínuas19. No entanto, uma limitação do uso da correlação de Pearson para determinar o acordo é que os dois métodos aqui utilizados podem fornecer resultados relacionados, mas um método pode resultar em valores gerais mais elevados do que o outro devido ao viés sistemático. Portanto, a correlação de Pearson é uma boa medida de acordo relativo19. Para aumentar a robustez do protocolo, podemser utilizados métodos adicionais para confirmar o acordo absoluto, como comparar a área média 6E10-positiva pelos dois métodos (Figura 5E). Em conjunto, o protocolo atual compara a carga Aβ detectada pela coloração imunofluorescente e analisa as sub-regiões de interesse em seções de tecido cerebral. Os resultados mostram uma forte correlação entre esses dois métodos para seções de tecido cerebral derivadas de camundongos machos APP/PS1 de 13 meses de idade que mostram depósitos abundantes de Aβ.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de Envelhecimento dos Institutos Nacionais de Saúde sob os números de premiação R01AG062840 (para RKS) e R01AG072896 (para RKS). O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde. Aproximadamente US$ 200 mil (100%) dos fundos federais apoiaram este projeto. Também gostaríamos de agradecer ao Dr. Joshua Yang por sua ajuda com a edição de manuscritos.
Materials
| 15 mL conical tubes | ThermoFisher Scientific, MA, USA | 339650 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| 24-well plates | Fisher Scientific, NH, USA | FB012929 | https://www.fishersci.com/shop/products/jet-biofil-surface-treated-steriletissue-culture-plates-3/FB012929 |
| Amyloid beta 42 human ELISA kit | ThermoFisher Scientific, MA, USA | KHB3441 | https://www.thermofisher.com/elisa/product/Amyloid-beta-42-Human-ELISA-Kit/KHB3441 |
| Aqueous mounting media | Vector laboratories, CA, USA | H-5501-60 | https://vectorlabs.com/products/mounting/vectamount-aq-aqueous-mounting-medium |
| Bovine serum albumin | Sigmaaldrich, MO, USA | A2153-50G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/a2153?gclid=CjwKCAjw9aiIBhA1EiwAJ_G TSiZ9B3YGz3RvSpWqCH4CPW78 Dj4WlgxmzPs631z5IHmy5XLV TdC_jBoC9zQQAvD_BwE |
| BZ-X710 Keyence all-in-one fluorescence microscope | Keyence, IL, USA | BZ-X710 | https://www.keyence.com/products/microscope/fluorescence-microscope/bz-x700/models/bz-x710/ |
| Clear nail poilsh | User preference | NA | None |
| Cryostat | Leica Biosystems, IL, USA | Leica CM1860 Cryostat | https://www.leicabiosystems.com/us/histology-equipment/cryostats/leica-cm1860/ |
| Formic acid | Sigmaaldrich, MO, USA | F0507-500ML | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigald/f0507?gclid=CjwKCAjw9aiIBhA1EiwAJ_G TSheH6JMGnla50C3Ag0cLzXE8 BObxvDApl0udjYAPZmBGe7a 8PRUv1RoCt34QAvD_BwE |
| Glass coverslips | VWR, PA, USA | 48393-081 | https://us.vwr.com/store/product/4645817/vwr-micro-cover-glasses-rectangular |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, CA, USA | Version 8 | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
| ImageJ 1.51k | National Institutes of Health, MD, USA | Version 1.53e | https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| Mice | Jackson Laboratories, ME, USA | 034829-JAX | https://www.mmrrc.org/catalog/sds.php?mmrrc_id=34829 |
| Paraformaldehyde | Sigmaaldrich, MO, USA | P6148-500G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sial/p6148?gclid=CjwKCAjw9aiIBhA1EiwAJ_G TShtLb9Ax9MmRyrFn6Rfmmg 1l52_5XZFXOeXT24ik8Lkw GH7fvlDoHBoChzYQAvD_BwE |
| Phenytoin/pentobarbital based anesthetic (Euthasol) | Patterson Veterinary, MA, USA | 07-805-9296 | https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_32818 |
| Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific, NH, USA | BP661-50 | https://www.fishersci.com/shop/products/pbs-1x-powder-concentrate-white-granular-powder-fisher-bioreagents-2/BP66150 |
| Plus (+) microscope slides | Ted Pella, Inc., CA, USA | 260100 | https://www.tedpella.com/histo_html/slides.htm#260384 |
| Primary antibody (6E10) | Biolegend, CA, USA | 803013 | https://www.biolegend.com/en-us/products/alexa-fluor-488-anti-beta-amyloid-1-16-antibody-10833 |
| Sucrose | Sigmaaldrich, MO, USA | 47289 | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/supelco/47289?gclid=CjwKCAjw9aiIBhA1EiwAJ_ GTSuwlymWL_PUl2KIMHymi GLOWluZdPjf3pRcjMEjQD siItfWiG-C2-RoCxyoQAvD_BwE |
| Triton X 100 | Sigmaaldrich, MO, USA | T8787-100ML | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8787?context=product |
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