Cuantificación completa versus subregional de la carga beta amiloide en secciones cerebrales de ratón
Summary
El presente protocolo describe y compara el procedimiento para realizar un análisis de región o subregión de interés completa de secciones cerebrales de ratón sagitales para cuantificar la carga beta amiloide en el modelo de ratón transgénico APP / PS1 de la enfermedad de Alzheimer.
Abstract
La acumulación extracelular de placas de beta-amiloide (Aβ) es una de las principales características patológicas de la enfermedad de Alzheimer (EA), y es el objetivo del único tratamiento modificador de la enfermedad aprobado por la FDA para la EA. En consecuencia, el uso de modelos de ratones transgénicos que sobreexpresan la proteína precursora de amiloide y, por lo tanto, acumulan placas cerebrales de Aβ se utilizan ampliamente para modelar la EA humana en ratones. Por lo tanto, los inmunoensayos, incluido el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) y la inmunotinción, comúnmente miden la carga de Aβ en los tejidos cerebrales derivados de ratones transgénicos con EA. Aunque los métodos para la detección y cuantificación de Aβ han sido bien establecidos y documentados, no se ha informado del impacto del tamaño de la región de interés seleccionada en el tejido cerebral en las mediciones de carga de Aβ después de la inmunotinción. Por lo tanto, el protocolo actual tenía como objetivo comparar las mediciones de carga Aβ en todas las regiones y subregiones de interés utilizando un software de análisis de imágenes. Los pasos involucrados en la preparación del tejido cerebral, la inmunotinción de la sección cerebral de flotación libre, las imágenes y la cuantificación de la carga de Aβ en subregiones de interés completas versus subregiones de interés se describen utilizando secciones cerebrales derivadas de ratones machos transgénicos dobles APP / PS1 de 13 meses de edad. El protocolo actual y los resultados proporcionan información valiosa sobre el impacto del tamaño de la región de interés en la cuantificación del área Aβ-positiva, y muestran una fuerte correlación entre el área Aβ-positiva obtenida utilizando los análisis completos y subregiones de interés para secciones cerebrales derivadas de ratones MACHO APP / PS1 de 13 meses de edad que muestran una deposición generalizada de Aβ.
Introduction
La enfermedad de Alzheimer (EA), la sexta causa principal de muerte en los Estados Unidos, sigue siendo una amenaza para la salud pública, con un estimado de 6.2 millones de estadounidenses que viven con EA. Se espera que esto alcance los 13,8 millones para 20601. Hasta la fecha, el manejo sintomático a través de medicamentos como los inhibidores de la colinesterasa y la memantina es el curso primario del tratamiento2. La EA se caracteriza por manifestaciones neuropatológicas como la deposición extracelular de placas de beta-amiloide (Aβ) y la acumulación intracelular de tau hiperfosforilada en forma de ovillos neurofibrilares 3,4. Formado por una escisión endoproteolítica de la proteína precursora de amiloide (APP) a través de beta- y gamma-secretasa, Aβ se agrega para formar oligómeros y fibrillas, lo que lleva a efectos neurotóxicos5. Se ha planteado la hipótesis de que Aβ cumple un papel patológico primario desde la década de 1980, y es el objetivo terapéutico de la única terapia modificadora de la enfermedad aprobada por la FDA para la EA6. Como resultado, los modelos de ratones transgénicos con EA que albergan mutaciones en genes que resultan en una acumulación cerebral robusta de Aβ se han utilizado ampliamente para la investigación preclínica de la EA desde principios de la década de 19907.
La detección de especies de Aβ en estos cerebros de ratones transgénicos con EA generalmente se realiza mediante dos inmunoensayos: ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) e inmunotinción. El primer ensayo permite la determinación cuantitativa de diferentes especies de Aβ y consume menos tiempo en comparación con la inmunotinción, que requiere varios pasos secuenciales de procesamiento de tejidos e imágenes, que incluyen seccionamiento de tejidos, inmunotinción, imágenes y cuantificación8. Además, los resultados obtenidos tras la inmunotinción sonsemicuantitativos 8. Sin embargo, la capacidad de localizar espacialmente Aβ hace que la inmunotinción sea un enfoque atractivo para la detección de Aβ en tejidos cerebrales8.
Durante el uso de la inmunotinción Aβ, diferentes grupos de investigación han empleado varios paradigmas de cuantificación diferentes. Por ejemplo, algunos grupos de investigación cuantifican la carga de Aβ en toda la región de interés (corteza o hipocampo), mientras que otros cuantifican la carga de Aβ en una subregión de interés específica (una parte de la corteza o el hipocampo)9,10,11. Aunque los métodos para la detección y cuantificación de Aβ han sido bien establecidos y documentados, no se ha informado del impacto del tamaño de la región de interés en las mediciones de carga de Aβ después de la inmunotinción. Por lo tanto, el protocolo actual tenía como objetivo comparar las mediciones de carga de Aβ en todas las regiones y subregiones de interés utilizando un software de análisis de imágenes, ImageJ.
El estudio actual utilizó ratones machos transgénicos dobles APP / PS1 de 13 meses de edad, que expresan un APP quimérico de ratón / humano y una presenilina mutante 1, para modelar el inicio temprano de AD12. Los depósitos de Aβ comienzan a desarrollarse a los 6-7 meses de edad, y se observa una abundante acumulación de Aβ tanto en la corteza como en el hipocampo de estos ratones a los 9-10 meses de edad12. Los péptidos amiloides transgénicos y la holoproteína pueden ser detectados por 6E10-inmunotinción13, lo que lo convierte en un modelo animal deseable para el presente protocolo. El procedimiento cubierto en este documento incluye la preparación del tejido cerebral, la inmunotinción de secciones que flotan libremente, la obtención de imágenes y la cuantificación de la carga de Aβ en subregiones completas versus subregiones de interés. El análisis muestra una fuerte correlación entre la cuantificación completa y subregional, lo que indica un acuerdo sólido entre estos dos métodos en las secciones de tejido cerebral derivadas de ratones machos APP / PS1 de 13 meses de edad que muestran abundantes depósitos de Aβ.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito aquí describe el procedimiento para la preparación hemi-cerebral para la sección sagital, la tinción inmunofluorescente de los depósitos de Aβ utilizando el anticuerpo 6E10 en secciones que flotan libremente, la obtención de imágenes de las secciones cerebrales teñidas de Aβ seguidas de la cuantificación de los depósitos de Aβ en la corteza y el hipocampo del tejido cerebral del ratón utilizando un software de análisis de imágenes. Si bien existen protocolos publicados para cuantificar la carga de Aβ en las secciones 8,10 del tejido cerebral, este protocolo describe los pasos involucrados en la cuantificación de la carga de Aβ en toda la isocorteza (conocida como corteza) y el hipocampo en comparación con la carga de Aβ en una subregión de interés en la corteza y el hipocampo, cuando esto puede ser deseado. También se proporciona la correlación entre los análisis completos frente a las subregiones de interés.
Hay varios pasos críticos en el protocolo. En primer lugar, el protocolo descrito es para secciones de tejido cerebral de 20 μm de espesor sometidas a inmunotinción flotante, lo que resulta en una penetración óptima de anticuerpos dentro de la sección18 del tejido. La técnica de flotación libre puede requerir que las secciones de tejido se transfieran manualmente entre las diferentes soluciones durante la tinción inmunofluorescente y el manejo cuidadoso de las secciones de tejido durante todo el procedimiento. Esto es especialmente crucial cuando las secciones de tejido se sumergen en la solución de ácido fórmico al 70% para la recuperación de antígenos en el protocolo actual, lo que aumenta la fragilidad del tejido para secciones delgadas. Los enfoques alternativos al protocolo descrito incluyen el uso de secciones de tejido más gruesas (por ejemplo, 30-40 μm) o el uso de secciones de tejido que se montan directamente en portaobjetos cargados positivamente antes de la tinción inmunofluorescente. En segundo lugar, el protocolo descrito en este documento utiliza un anticuerpo 6E10 marcado fluorescentemente. Además de usar el anticuerpo 6E10 marcado fluorescentemente, los anticuerpos 6E10 no fluorescentes (por ejemplo, el anticuerpo 6E10 conjugado con peroxidasa de rábano picante) también se pueden usar para detectar la carga de Aβ en las secciones de tejido cerebral, y el protocolo actual se puede adaptar para cuantificar las tinciones inmunoquímicas Aβ positivas en las secciones de tejido cerebral como se describió anteriormente8 . En tercer lugar, la precisión de los resultados para la cuantificación de la carga Aβ dependerá de la selección de umbral adecuada en el software de análisis, que depende del fondo tisular y la intensidad de la señal. La selección del umbral debe ser realizada por el usuario final de tal manera que solo se seleccionen las tinciones Aβ-positivas para la cuantificación. Se requiere la intervención del usuario final para optimizar el umbral específico que se puede aplicar a todas las imágenes para garantizar la precisión de la configuración del umbral. Cuarto, dado que el análisis de la subregión de interés requiere seleccionar una pequeña región de interés en la sección de tejido, se utilizaron dos lectores independientes para este análisis. Para mantener la independencia y el cegamiento durante la recolección de datos, todas las imágenes fueron codificadas numéricamente; la secuencia de análisis de imágenes se aleatorizó entre los lectores de modo que los diferentes lectores analizaron diferentes imágenes en un momento dado, y los datos se enviaron al final de cada semana. Debido a la mayor probabilidad de variabilidad entre lectores en la selección de la región de interés en el análisis de la subregión de interés, los lectores fueron entrenados utilizando varias imágenes de muestra para optimizar la selección de regiones en la corteza y el hipocampo antes de comenzar la recopilación de datos. Este entrenamiento es crucial para reducir la variabilidad entre lectores, y como se puede ver (Figura 5A, B), el área 6E10 positiva reportada por ambos lectores muestra un fuerte acuerdo relativo en el estudio actual.
El protocolo actual y los resultados proporcionan información valiosa sobre el impacto del tamaño de la región de interés en la cuantificación del área Aβ positiva. Se espera que una región de interés más grande represente el tejido más que una región de interés más pequeña. Por lo tanto, el muestreo de un tejido más grande es deseable para cuantificar con precisión la carga de Aβ en los tejidos. Sin embargo, en el caso de la distribución homogénea de la carga Aβ dentro del tejido, una región de muestreo más pequeña generalmente se considera una buena representación del tejido más grande bajo análisis. Los resultados del estudio actual confirman esto, y la carga de Aβ en toda la corteza y el hipocampo fue un fuerte correlato de la carga de Aβ en una subregión seleccionada de la corteza y el hipocampo (Figura 5C, D). Para confirmar aún más la concordancia entre los análisis de regiones de interés completas y subregiones, se comparó el área media 6E10 positiva en la corteza y el hipocampo, y no se encontraron diferencias entre los dos métodos (Figura 5E). Esto confirma que cualquiera de estos métodos (análisis de subregión completa o subregión) produce mediciones de carga Aβ comparables.
El protocolo actual tiene algunas limitaciones. Los dos métodos (análisis de región completa versus subregión) no siempre se pueden usar indistintamente. La elección de utilizar el análisis de región completa o subregión dependerá de la distribución regional de Aβ dentro del tejido, que se ve afectada por la edad, el sexo y la cepa del modelo de ratón con EA. A los 13 meses, la carga de Aβ se distribuye por toda la corteza y el hipocampo de los ratones APP/PS1. Sin embargo, a los 6 meses, los depósitos de Aβ se limitan a la corteza, y se observan depósitos mínimos en el hipocampo12. En tales condiciones, el análisis de la región completa de interés puede ser el enfoque deseado para aumentar el área de muestreo de tejido y, por lo tanto, la señal Aβ. Por otro lado, el análisis de subregiones puede ser el método de elección cuando la carga de Aβ en una región específica del cerebro es de interés (por ejemplo, la corteza somatosensorial). Además, a los 13 meses, los ratones macho APP/PS1 demuestran intensas tinciones 6E10 positivas, y la tinción inmunofluorescente da como resultado una excelente señal con un fondo muy bajo, lo que hace que el protocolo actual sea muy adecuado para la cuantificación en las condiciones dadas. No está claro si este método de cuantificación se puede aplicar con éxito a la tinción menos intensa, y se requerirá trabajo futuro para responder a esta pregunta. El método de cuantificación inmunofluorescente y de imagen presentado aquí detecta todas las formas de Aβ, incluida la formaprecursora 13. Como resultado, si existe un interés en la detección de una especie Aβ específica (por ejemplo, Aβ1-40 o Aβ1-42), se pueden utilizar anticuerpos específicos para estas isoformas Aβ. Por lo tanto, aunque el método de tinción y detección inmunofluorescente 6E10 se correlacionó con las mediciones de las mediciones de Aβ1-42 en homogeneizados de todo el cerebro utilizando ELISA (Figura 5F, G), la correlación fue solo modesta. Esto se puede atribuir a la medición de solo Aβ1-42 utilizando el ELISA y la detección de todas las especies de Aβ utilizando la inmunotinción 6E10. El presente estudio utiliza tres lectores para evaluar el acuerdo y la correlación entre los análisis completos y subregionales. Tener lectores adicionales puede mejorar la solidez del estudio y puede validar aún más los acuerdos entre los dos métodos presentados aquí. Además, utilizamos la correlación de Pearson como medida de concordancia, que es ampliamente utilizada entre otros métodos para describir la concordancia entre variables continuas19. Sin embargo, una limitación del uso de la correlación de Pearson para determinar el acuerdo es que los dos métodos utilizados en este documento pueden proporcionar resultados relacionados, pero un método puede dar lugar a valores generales más altos que el otro debido al sesgo sistemático. Por lo tanto, la correlación de Pearson es una buena medida del acuerdo relativo19. Para aumentar la robustez del protocolo, se pueden utilizar métodos adicionales para confirmar el acuerdo absoluto, como la comparación del área media 6E10 positiva por los dos métodos (Figura 5E),19. En conjunto, el protocolo actual compara la carga de Aβ detectada por tinción inmunofluorescente y analiza las regiones completas y subregiones de interés en las secciones de tejido cerebral. Los resultados muestran una fuerte correlación entre estos dos métodos para las secciones de tejido cerebral derivadas de ratones machos APP / PS1 de 13 meses de edad que muestran abundantes depósitos de Aβ.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional de Envejecimiento de los Institutos Nacionales de Salud bajo los números de premio R01AG062840 (a RKS) y R01AG072896 (a RKS). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud. Aproximadamente $ 200k (100%) de fondos federales apoyaron este proyecto. También nos gustaría agradecer al Dr. Joshua Yang por su ayuda con la edición de manuscritos.
Materials
| 15 mL conical tubes | ThermoFisher Scientific, MA, USA | 339650 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| 24-well plates | Fisher Scientific, NH, USA | FB012929 | https://www.fishersci.com/shop/products/jet-biofil-surface-treated-steriletissue-culture-plates-3/FB012929 |
| Amyloid beta 42 human ELISA kit | ThermoFisher Scientific, MA, USA | KHB3441 | https://www.thermofisher.com/elisa/product/Amyloid-beta-42-Human-ELISA-Kit/KHB3441 |
| Aqueous mounting media | Vector laboratories, CA, USA | H-5501-60 | https://vectorlabs.com/products/mounting/vectamount-aq-aqueous-mounting-medium |
| Bovine serum albumin | Sigmaaldrich, MO, USA | A2153-50G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/a2153?gclid=CjwKCAjw9aiIBhA1EiwAJ_G TSiZ9B3YGz3RvSpWqCH4CPW78 Dj4WlgxmzPs631z5IHmy5XLV TdC_jBoC9zQQAvD_BwE |
| BZ-X710 Keyence all-in-one fluorescence microscope | Keyence, IL, USA | BZ-X710 | https://www.keyence.com/products/microscope/fluorescence-microscope/bz-x700/models/bz-x710/ |
| Clear nail poilsh | User preference | NA | None |
| Cryostat | Leica Biosystems, IL, USA | Leica CM1860 Cryostat | https://www.leicabiosystems.com/us/histology-equipment/cryostats/leica-cm1860/ |
| Formic acid | Sigmaaldrich, MO, USA | F0507-500ML | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigald/f0507?gclid=CjwKCAjw9aiIBhA1EiwAJ_G TSheH6JMGnla50C3Ag0cLzXE8 BObxvDApl0udjYAPZmBGe7a 8PRUv1RoCt34QAvD_BwE |
| Glass coverslips | VWR, PA, USA | 48393-081 | https://us.vwr.com/store/product/4645817/vwr-micro-cover-glasses-rectangular |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, CA, USA | Version 8 | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
| ImageJ 1.51k | National Institutes of Health, MD, USA | Version 1.53e | https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| Mice | Jackson Laboratories, ME, USA | 034829-JAX | https://www.mmrrc.org/catalog/sds.php?mmrrc_id=34829 |
| Paraformaldehyde | Sigmaaldrich, MO, USA | P6148-500G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sial/p6148?gclid=CjwKCAjw9aiIBhA1EiwAJ_G TShtLb9Ax9MmRyrFn6Rfmmg 1l52_5XZFXOeXT24ik8Lkw GH7fvlDoHBoChzYQAvD_BwE |
| Phenytoin/pentobarbital based anesthetic (Euthasol) | Patterson Veterinary, MA, USA | 07-805-9296 | https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_32818 |
| Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific, NH, USA | BP661-50 | https://www.fishersci.com/shop/products/pbs-1x-powder-concentrate-white-granular-powder-fisher-bioreagents-2/BP66150 |
| Plus (+) microscope slides | Ted Pella, Inc., CA, USA | 260100 | https://www.tedpella.com/histo_html/slides.htm#260384 |
| Primary antibody (6E10) | Biolegend, CA, USA | 803013 | https://www.biolegend.com/en-us/products/alexa-fluor-488-anti-beta-amyloid-1-16-antibody-10833 |
| Sucrose | Sigmaaldrich, MO, USA | 47289 | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/supelco/47289?gclid=CjwKCAjw9aiIBhA1EiwAJ_ GTSuwlymWL_PUl2KIMHymi GLOWluZdPjf3pRcjMEjQD siItfWiG-C2-RoCxyoQAvD_BwE |
| Triton X 100 | Sigmaaldrich, MO, USA | T8787-100ML | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8787?context=product |
References
- Alzheimer’s Association. 2021 Alzheimer’s disease facts and figures. Alzheimer’s & Dementia. 17 (3), 327-406 (2021).
- Langa, K. M., Foster, N. L., Larson, E. B. Mixed dementia: emerging concepts and therapeutic implications. Journal of the American Medical Association. 292 (23), 2901-2908 (2004).
- Gandy, S., DeKosky, S. T. Toward the treatment and prevention of Alzheimer’s disease: rational strategies and recent progress. Annual Review of Medicine. 64, 367-383 (2013).
- Bloom, G. S. Amyloid-beta and tau: the trigger and bullet in Alzheimer disease pathogenesis. JAMA Neurology. 71 (4), 505-508 (2014).
- Gremer, L., et al. Fibril structure of amyloid-beta(1-42) by cryo-electron microscopy. Science. 358 (6359), 116-119 (2017).
- Ferrero, J., et al. First-in-human, double-blind, placebo-controlled, single-dose escalation study of aducanumab (BIIB037) in mild-to-moderate Alzheimer’s disease. Alzheimer’s & Dementia Translational Research & Clinical Interventions. 2 (3), 169-176 (2016).
- Poon, C. H., Wang, Y., Fung, M. L., Zhang, C., Lim, L. W. Rodent models of amyloid-beta feature of Alzheimer’s disease: development and potential treatment implications. Aging and Disease. 11 (5), 1235-1259 (2020).
- Christensen, A., Pike, C. J. Staining and quantification of beta-amyloid pathology in transgenic mouse models of Alzheimer’s disease. Methods in Molecular Biology. 2144, 221 (2020).
- Thakker, D. R., et al. Intracerebroventricular amyloid-beta antibodies reduce cerebral amyloid angiopathy and associated micro-hemorrhages in aged Tg2576 mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (11), 4501-4506 (2009).
- Song, Z., et al. Detecting amyloid-beta accumulation via immunofluorescent staining in a mouse model of Alzheimer’s disease. Journal of Visualized Experiments. (170), e62254 (2021).
- Sun, J., et al. Hematologic safety of chronic brain-penetrating erythropoietin dosing in APP/PS1 mice. Alzheimer’s & DementiaTranslational Research & Clinical Interventions. 5, 627-636 (2019).
- Jankowsky, J. L., et al. Mutant presenilins specifically elevate the levels of the 42 residue beta-amyloid peptide in vivo: evidence for augmentation of a 42-specific gamma secretase. Human Molecular Genetics. 13 (2), 159-170 (2004).
- Grant, M. K. O., et al. Human cerebrospinal fluid 6E10-immunoreactive protein species contain amyloid precursor protein fragments. PloS One. 14 (2), 0212815 (2019).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Eichenbaum, K. D., et al. Minimally invasive method for murine brain fixation. Biotechniques. 39 (4), 487-490 (2005).
- Chang, R., et al. Blood-brain barrier penetrating biologic tnf-alpha inhibitor for Alzheimer’s disease. Molecular Pharmaceutics. 14 (7), 2340-2349 (2017).
- Pinskiy, V., et al. High-throughput method of whole-brain sectioning, using the tape-transfer technique. PloS One. 10 (7), 0102363 (2015).
- Potts, E. M., Coppotelli, G., Ross, J. M. Histological-based stainings using free-floating tissue sections. Journal of Visualized Experiments. (162), e61622 (2020).
- van Stralen, K. J., Dekker, F. W., Zoccali, C., Jager, K. J. Measuring agreement, more complicated than it seems. Nephron Clinical Practice. 120 (3), 162-167 (2012).
