Quantification complète ou sous-régionale de la charge bêta-amyloïde sur les sections cérébrales de souris
Summary
Le présent protocole décrit et compare la procédure permettant d’effectuer une analyse complète de région ou de sous-région d’intérêt de sections cérébrales de souris sagittales afin de quantifier la charge bêta-amyloïde dans le modèle murin transgénique APP/PS1 de la maladie d’Alzheimer.
Abstract
L’accumulation extracellulaire de plaques bêta-amyloïdes (Aβ) est l’une des principales caractéristiques pathologiques de la maladie d’Alzheimer (MA) et est la cible du seul traitement modificateur de la maladie approuvé par la FDA pour la MA. En conséquence, l’utilisation de modèles murins transgéniques qui surexpriment la protéine précurseur amyloïde et accumulent ainsi des plaques Aβ cérébrales est largement utilisée pour modéliser la MA humaine chez la souris. Par conséquent, les immunoessais, y compris le test immuno-enzymatique (ELISA) et l’immunocoloration, mesurent généralement la charge Aβ dans les tissus cérébraux dérivés de souris transgéniques AD. Bien que les méthodes de détection et de quantification de l’Aβ aient été bien établies et documentées, l’impact de la taille de la région d’intérêt sélectionnée dans le tissu cérébral sur les mesures de la charge Aβ après l’immunocoloration n’a pas été rapporté. Par conséquent, le protocole actuel visait à comparer les mesures de charge Aβ à travers les régions complètes et sous-régions d’intérêt à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images. Les étapes impliquées dans la préparation des tissus cérébraux, l’immunocoloration de la section cérébrale flottante librement, l’imagerie et la quantification de la charge Aβ dans les régions d’intérêt complètes par rapport aux sous-régions d’intérêt sont décrites à l’aide de sections cérébrales dérivées de souris mâles app/PS1 double transgéniques âgées de 13 mois. Le protocole actuel et les résultats fournissent des informations précieuses sur l’impact de la taille de la région d’intérêt sur la quantification de l’aire Aβ-positive, et montrent une forte corrélation entre la zone Aβ-positive obtenue à l’aide des analyses des régions complètes et des sous-régions d’intérêt pour les coupes cérébrales dérivées de souris APP/PS1 mâles de 13 mois qui présentent un dépôt Aβ généralisé.
Introduction
La maladie d’Alzheimer (MA), la sixième cause de décès aux États-Unis, continue d’être une menace pour la santé publique, avec environ 6,2 millions d’Américains vivant avec la MA. Ce chiffre devrait atteindre 13,8 millions d’ici 20601. À ce jour, la prise en charge symptomatique par des médicaments tels que les inhibiteurs de la cholinestérase et la mémantine est le principal traitement2. La MA est caractérisée par des manifestations neuropathologiques telles que le dépôt extracellulaire de plaques bêta-amyloïdes (Aβ) et l’accumulation intracellulaire de tau hyperphosphorylé sous la forme d’enchevêtrements neurofibrillaires 3,4. Formé par un clivage endoprotéolytique de la protéine précurseur de l’amyloïde (APP) via la bêta- et la gamma-sécrétase, Aβ s’agrège pour former des oligomères et des fibrilles, entraînant des effets neurotoxiques5. Aβ a été supposé servir un rôle pathologique primaire depuis les années 1980, et est la cible thérapeutique de la seule thérapie modificateur de la maladie approuvée par la FDA pour AD6. En conséquence, les modèles murins transgéniques de la MA hébergeant des mutations dans les gènes entraînant une accumulation robuste d’Aβ cérébrale ont été largement utilisés pour la recherche préclinique sur la MA depuis le début des années 19907.
La détection des espèces Aβ dans ces cerveaux de souris transgéniques AD se fait généralement à l’aide de deux immunoessais: le test immuno-enzymatique (ELISA) et l’immunocoloration. Le premier essai permet la détermination quantitative de différentes espèces d’Aβ et prend moins de temps que l’immunocoloration, qui nécessite plusieurs étapes séquentielles de traitement et d’imagerie des tissus, y compris la section des tissus, l’immunocoloration, l’imagerie et la quantification8. De plus, les résultats obtenus après immunocoloration sont semi-quantitatifs8. Cependant, la capacité de localiser spatialement Aβ fait de l’immunocoloration une approche attrayante pour la détection de l’Aβ dans les tissus cérébraux8.
Lors de l’utilisation de l’immunocoloration Aβ, plusieurs paradigmes de quantification différents ont été utilisés par différents groupes de recherche. Par exemple, certains groupes de recherche quantifient la charge Aβ dans toute la région d’intérêt (cortex ou hippocampe), tandis que d’autres quantifient la charge Aβ dans une sous-région d’intérêt spécifiée (une partie du cortex ou de l’hippocampe)9,10,11. Bien que les méthodes de détection et de quantification de l’Aβ aient été bien établies et documentées, l’impact de la taille de la région d’intérêt sur les mesures de la charge Aβ après l’immunocoloration n’a pas été rapporté. Par conséquent, le protocole actuel visait à comparer les mesures de charge Aβ à travers les régions complètes et sous-régions d’intérêt à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images, ImageJ.
L’étude actuelle a utilisé des souris mâles double transgéniques APP/PS1 âgées de 13 mois, qui expriment une souris chimérique / APP humaine et une préséniline 1 mutante, pour modéliser l’apparition précoce de la MA12. Les dépôts d’Aβ commencent à se développer à l’âge de 6-7 mois, et une accumulation abondante d’Aβ est observée à la fois dans le cortex et l’hippocampe de ces souris à l’âge de 9-10 mois de12 ans. Les peptides amyloïdes transgéniques et l’holoprotéine peuvent être détectés par 6E10-immunocolorant13, ce qui en fait un modèle animal souhaitable pour le présent protocole. La procédure couverte ici comprend la préparation du tissu cérébral, l’immunocoloration des sections flottantes, l’imagerie et la quantification de la charge Aβ dans les régions complètes par rapport aux sous-régions d’intérêt. L’analyse montre une forte corrélation entre la quantification complète et sous-régionale, indiquant un accord robuste entre ces deux méthodes dans les coupes de tissu cérébral dérivées de souris mâles APP/PS1 âgées de 13 mois qui présentent des dépôts abondants d’Aβ.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole décrit ici décrit décrit la procédure de préparation hémi-cérébrale pour la section sagittale, la coloration immunofluorescente des dépôts Aβ à l’aide de l’anticorps 6E10 sur des sections flottantes librement, l’imagerie des sections cérébrales colorées Aβ suivie de la quantification des dépôts Aβ dans le cortex et l’hippocampe du tissu cérébral de souris à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images. Bien qu’il existe des protocoles publiés pour quantifier la charge Aβ dans les sections de tissu cérébral 8,10, ce protocole décrit les étapes impliquées dans la quantification de la charge Aβ dans l’ensemble de l’iso-cortex (appelé cortex) et de l’hippocampe par rapport à la charge Aβ dans une sous-région d’intérêt dans le cortex et l’hippocampe, lorsque cela peut être souhaité. La corrélation entre les analyses complètes et les sous-régions d’intérêt est également fournie.
Il y a plusieurs étapes critiques dans le protocole. Tout d’abord, le protocole décrit concerne des coupes de tissu cérébral de 20 μm d’épaisseur soumises à une immunocoloration flottante, ce qui entraîne une pénétration optimale des anticorps dans la section tissulaire18. La technique de flottement libre peut nécessiter que les sections de tissus soient transférées manuellement entre les différentes solutions pendant la coloration immunofluorescente et qu’elles soient manipulées avec soin tout au long de la procédure. Ceci est particulièrement crucial lorsque les sections de tissus sont immergées dans la solution d’acide formique à 70% pour la récupération de l’antigène dans le protocole actuel, ce qui augmente la fragilité des tissus pour les sections minces. D’autres approches au protocole décrit comprennent l’utilisation de coupes de tissus plus épaisses (p. ex., 30 à 40 μm) ou de sections de tissus directement montées sur des lames chargées positivement avant la coloration immunofluorescente. Deuxièmement, le protocole décrit ici utilise un anticorps 6E10 marqué par fluorescence. Outre l’utilisation de l’anticorps 6E10 marqué par fluorescence, les anticorps 6E10 non fluorescents (par exemple, l’anticorps 6E10 conjugué à la peroxydase de raifort) peuvent également être utilisés pour détecter la charge Aβ dans les coupes de tissu cérébral, et le protocole actuel peut être adapté pour quantifier les taches immunochimiques Aβ positives dans les sections de tissu cérébral comme décrit précédemment8 . Troisièmement, l’exactitude des résultats pour la quantification de la charge Aβ dépendra de la sélection appropriée du seuil dans le logiciel d’analyse, qui dépend du fond tissulaire et de l’intensité du signal. La sélection du seuil doit être effectuée par l’utilisateur final de manière à ce que seules les taches Aβ positives soient sélectionnées pour la quantification. L’intervention de l’utilisateur final est nécessaire pour optimiser le seuil spécifique qui peut être appliqué à toutes les images afin d’assurer la précision du réglage du seuil. Quatrièmement, étant donné que l’analyse de la sous-région d’intérêt nécessite la sélection d’une petite région d’intérêt dans la section des tissus, deux lecteurs indépendants ont été utilisés pour cette analyse. Pour maintenir l’indépendance et l’aveuglement lors de la collecte des données, toutes les images ont été codées par numéro; la séquence d’analyse d’images a été randomisée entre les lecteurs de sorte que les différents lecteurs ont analysé différentes images à un moment donné, et les données ont été soumises à la fin de chaque semaine. En raison de la probabilité accrue de variabilité entre lecteurs dans la sélection de la région d’intérêt dans la sous-région d’analyse d’intérêt, les lecteurs ont été formés à l’aide de plusieurs images d’échantillon pour optimiser la sélection de la région dans le cortex et l’hippocampe avant de commencer la collecte de données. Cette formation est cruciale pour réduire la variabilité entre les lecteurs et, comme on peut le voir (Figure 5A, B), la zone 6E10 positive rapportée par les deux lecteurs montre un fort accord relatif dans la présente étude.
Le protocole actuel et les résultats fournissent des informations précieuses sur l’impact de la région de taille d’intérêt sur la quantification de la zone Aβ-positive. On s’attend à ce qu’une plus grande région d’intérêt représente le tissu plus qu’une région d’intérêt plus petite. Par conséquent, l’échantillonnage d’un tissu plus grand est souhaitable pour quantifier avec précision la charge Aβ dans les tissus. Cependant, dans le cas d’une distribution homogène de la charge Aβ dans le tissu, une région d’échantillonnage plus petite est généralement considérée comme une bonne représentation du plus grand tissu analysé. Les résultats de l’étude actuelle le confirment, et la charge Aβ dans l’ensemble du cortex et de l’hippocampe était un fort corrélat de la charge Aβ dans une sous-région sélectionnée du cortex et de l’hippocampe (Figure 5C,D). Pour confirmer davantage l’accord entre les analyses des régions complètes et des sous-régions d’intérêt, l’aire moyenne 6E10 positive dans le cortex et l’hippocampe a été comparée, et aucune différence entre les deux méthodes (Figure 5E) n’a été trouvée. Cela confirme que l’une ou l’autre de ces méthodes (analyse complète ou sous-région) donne des mesures de charge Aβ comparables.
Le protocole actuel comporte certaines limites. Les deux méthodes (analyse par région complète ou par sous-région) ne sont pas toujours utilisées de manière interchangeable. Le choix d’utiliser l’analyse complète ou sous-région dépendra de la distribution régionale d’Aβ dans le tissu, qui est influencée par l’âge, le sexe et la souche du modèle murin AD. À 13 mois, la charge Aβ est répartie dans tout le cortex et l’hippocampe des souris APP/PS1. Cependant, à 6 mois, les dépôts d’Aβ sont limités au cortex et des dépôts minimes sont observés dans l’hippocampe12. Dans de telles conditions, l’analyse de la région d’intérêt complète peut être l’approche souhaitée pour augmenter la zone d’échantillonnage tissulaire et donc le signal Aβ. D’autre part, l’analyse de sous-région peut être la méthode de choix lorsque la charge Aβ dans une région spécifique du cerveau est intéressante (par exemple, le cortex somatosensoriel). De plus, à 13 mois, les souris mâles APP/PS1 présentent des taches intenses 6E10 positives, et la coloration immunofluorescente donne un excellent signal avec un fond très faible, ce qui rend le protocole actuel très approprié pour la quantification dans les conditions données. Il n’est pas clair si cette méthode de quantification peut être appliquée avec succès à une coloration moins intense, et des travaux futurs seront nécessaires pour répondre à cette question. La méthode immunofluorescente et de quantification par image présentée ici détecte toutes les formes d’Aβ, y compris la forme précurseur13. Par conséquent, s’il y a un intérêt pour la détection d’une espèce Aβ spécifique (par exemple, Aβ1-40 ou Aβ1-42), des anticorps spécifiques à ces isoformes Aβ peuvent être utilisés. Par conséquent, bien que la méthode de coloration et de détection immunofluorescente 6E10 soit corrélée avec les mesures des mesures Aβ1-42 dans des homogénats cérébraux entiers à l’aide d’ELISA (Figure 5F, G), la corrélation n’était que modeste. Cela peut être attribué à la mesure de seulement Aβ1-42 à l’aide de l’ELISA et à la détection de toutes les espèces d’Aβ à l’aide de l’immunocoloration 6E10. La présente étude utilise trois lecteurs pour évaluer l’accord et la corrélation entre les analyses complètes et sous-régionales. Avoir des lecteurs supplémentaires peut améliorer la robustesse de l’étude et peut valider davantage les accords entre les deux méthodes présentées ici. De plus, nous utilisons la corrélation de Pearson comme mesure de l’accord, qui est largement utilisée parmi d’autres méthodes pour décrire l’accord entre les variables continues19. Cependant, l’une des limites de l’utilisation de la corrélation de Pearson pour déterminer l’accord est que les deux méthodes utilisées ici peuvent fournir des résultats connexes, mais une méthode peut entraîner des valeurs globalement plus élevées que l’autre en raison d’un biais systématique. Par conséquent, la corrélation de Pearson est une bonne mesure de l’accord relatif19. Pour accroître la robustesse du protocole, des méthodes supplémentaires pour confirmer l’accord absolu, telles que la comparaison de la zone moyenne positive de 6E10 par les deux méthodes (figure 5E), peuvent êtreutilisées 19. Pris ensemble, le protocole actuel compare la charge Aβ détectée par coloration immunofluorescente et analyse les régions complètes et sous-régions d’intérêt dans les sections de tissu cérébral. Les résultats montrent une forte corrélation entre ces deux méthodes pour les coupes de tissu cérébral dérivées de souris mâles APP/PS1 âgées de 13 mois qui présentent des dépôts abondants d’Aβ.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La recherche rapportée dans cette publication a été soutenue par le National Institute of Aging des National Institutes of Health sous les numéros d’attribution R01AG062840 (à RKS) et R01AG072896 (à RKS). Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les points de vue officiels des National Institutes of Health. Environ 200 000 $ (100 %) de fonds fédéraux ont appuyé ce projet. Nous tenons également à remercier le Dr Joshua Yang pour son aide à l’édition de manuscrits.
Materials
| 15 mL conical tubes | ThermoFisher Scientific, MA, USA | 339650 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| 24-well plates | Fisher Scientific, NH, USA | FB012929 | https://www.fishersci.com/shop/products/jet-biofil-surface-treated-steriletissue-culture-plates-3/FB012929 |
| Amyloid beta 42 human ELISA kit | ThermoFisher Scientific, MA, USA | KHB3441 | https://www.thermofisher.com/elisa/product/Amyloid-beta-42-Human-ELISA-Kit/KHB3441 |
| Aqueous mounting media | Vector laboratories, CA, USA | H-5501-60 | https://vectorlabs.com/products/mounting/vectamount-aq-aqueous-mounting-medium |
| Bovine serum albumin | Sigmaaldrich, MO, USA | A2153-50G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/a2153?gclid=CjwKCAjw9aiIBhA1EiwAJ_G TSiZ9B3YGz3RvSpWqCH4CPW78 Dj4WlgxmzPs631z5IHmy5XLV TdC_jBoC9zQQAvD_BwE |
| BZ-X710 Keyence all-in-one fluorescence microscope | Keyence, IL, USA | BZ-X710 | https://www.keyence.com/products/microscope/fluorescence-microscope/bz-x700/models/bz-x710/ |
| Clear nail poilsh | User preference | NA | None |
| Cryostat | Leica Biosystems, IL, USA | Leica CM1860 Cryostat | https://www.leicabiosystems.com/us/histology-equipment/cryostats/leica-cm1860/ |
| Formic acid | Sigmaaldrich, MO, USA | F0507-500ML | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigald/f0507?gclid=CjwKCAjw9aiIBhA1EiwAJ_G TSheH6JMGnla50C3Ag0cLzXE8 BObxvDApl0udjYAPZmBGe7a 8PRUv1RoCt34QAvD_BwE |
| Glass coverslips | VWR, PA, USA | 48393-081 | https://us.vwr.com/store/product/4645817/vwr-micro-cover-glasses-rectangular |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, CA, USA | Version 8 | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
| ImageJ 1.51k | National Institutes of Health, MD, USA | Version 1.53e | https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| Mice | Jackson Laboratories, ME, USA | 034829-JAX | https://www.mmrrc.org/catalog/sds.php?mmrrc_id=34829 |
| Paraformaldehyde | Sigmaaldrich, MO, USA | P6148-500G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sial/p6148?gclid=CjwKCAjw9aiIBhA1EiwAJ_G TShtLb9Ax9MmRyrFn6Rfmmg 1l52_5XZFXOeXT24ik8Lkw GH7fvlDoHBoChzYQAvD_BwE |
| Phenytoin/pentobarbital based anesthetic (Euthasol) | Patterson Veterinary, MA, USA | 07-805-9296 | https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_32818 |
| Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific, NH, USA | BP661-50 | https://www.fishersci.com/shop/products/pbs-1x-powder-concentrate-white-granular-powder-fisher-bioreagents-2/BP66150 |
| Plus (+) microscope slides | Ted Pella, Inc., CA, USA | 260100 | https://www.tedpella.com/histo_html/slides.htm#260384 |
| Primary antibody (6E10) | Biolegend, CA, USA | 803013 | https://www.biolegend.com/en-us/products/alexa-fluor-488-anti-beta-amyloid-1-16-antibody-10833 |
| Sucrose | Sigmaaldrich, MO, USA | 47289 | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/supelco/47289?gclid=CjwKCAjw9aiIBhA1EiwAJ_ GTSuwlymWL_PUl2KIMHymi GLOWluZdPjf3pRcjMEjQD siItfWiG-C2-RoCxyoQAvD_BwE |
| Triton X 100 | Sigmaaldrich, MO, USA | T8787-100ML | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8787?context=product |
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