Полная и субрегиональная количественная оценка бета-амилоидной нагрузки на участки мозга мыши
Summary
Настоящий протокол описывает и сравнивает процедуру выполнения анализа полной области или субрегиона, представляющего интерес, сагиттальных участков мозга мыши для количественной оценки бета-амилоидной нагрузки в трансгенной мышиной модели болезни Альцгеймера APP/PS1.
Abstract
Внеклеточное накопление бета-амилоидных (Aβ) бляшек является одним из основных патологических признаков болезни Альцгеймера (AD) и является целью единственного одобренного FDA лечения AD, модифицирующего заболевание. Соответственно, использование трансгенных мышиных моделей, которые чрезмерно экспрессируют белок-предшественник амилоида и тем самым накапливают церебральные Aβ-бляшки, широко используются для моделирования БА человека у мышей. Поэтому иммуноанализы, включая иммуноферментный анализ (ИФА) и иммуноокрашивание, обычно измеряют нагрузку Aβ в тканях мозга, полученных от трансгенных мышей AD. Хотя методы обнаружения и количественной оценки Aβ были хорошо установлены и задокументированы, о влиянии размера интересующей области, выбранной в ткани мозга, на измерения нагрузки Aβ после иммуноокрашивания не сообщалось. Таким образом, текущий протокол направлен на сравнение измерений нагрузки Aβ в полных и подобластных областях, представляющих интерес, с использованием программного обеспечения для анализа изображений. Этапы, связанные с подготовкой мозговой ткани, иммуноокрашиванием свободно плавающей секции мозга, визуализацией и количественной оценкой нагрузки Aβ в полных и подобластях, представляющих интерес, описаны с использованием участков мозга, полученных от 13-месячных двойных трансгенных самцов мышей APP / PS1. Текущий протокол и результаты предоставляют ценную информацию о влиянии размера интересующей области на количественную оценку Aβ-положительной области и показывают сильную корреляцию между Aβ-положительной областью, полученной с использованием полного и суб-областей, представляющих интерес для анализов участков мозга, полученных от 13-месячных самцов мышей APP / PS1, которые показывают широко распространенное осаждение Aβ.
Introduction
Болезнь Альцгеймера (БА), шестая по значимости причина смерти в Соединенных Штатах, продолжает представлять угрозу общественному здравоохранению, и, по оценкам, 6,2 миллиона американцев живут с БА. Ожидается, что к 2060году этот показатель достигнет 13,8 млн. На сегодняшний день симптоматическое лечение с помощью таких препаратов, как ингибиторы холинэстеразы и мемантин, является основным курсом лечения2. АД характеризуется нейропатологическими проявлениями, такими как внеклеточное отложение бета-амилоид-(Aβ) бляшек и внутриклеточное гиперфосфорилированное накопление тау в виде нейрофибриллярных клубков 3,4. Образуясь эндопротеолитическим расщеплением белка-предшественника амилоида (APP) через бета- и гамма-секретазу, Aβ агрегируется с образованием олигомеров и фибрилл, что приводит к нейротоксическим эффектам5. Предполагается, что Aβ выполняет основную патологическую роль с 1980-х годов и является терапевтической мишенью единственной одобренной FDA терапии, модифицирующей заболевание для AD6. В результате трансгенные мышиные модели AD, содержащие мутации в генах, приводящие к надежному накоплению Aβ в мозге, широко используются для доклинических исследований AD с начала 1990-х годов7.
Обнаружение видов Aβ в этих трансгенных мозгах мышей AD обычно осуществляется с использованием двух иммуноанализов: иммуноферментного анализа (ИФА) и иммуноокрашивания. Первый анализ позволяет количественно определять различные виды Aβ и является менее трудоемким по сравнению с иммуноокрашиванием, которое требует нескольких последовательных этапов обработки и визуализации тканей, включая сечение ткани, иммуноокрашивание, визуализацию и количественную оценку8. Далее результаты, полученные после иммуноокрашивания, являются полуколичественными8. Однако способность пространственно локализовать Aβ делает иммуноокрашивание привлекательным подходом для обнаружения Aβ в тканях мозга8.
При использовании иммуноокрашивания Aβ различными исследовательскими группами было использовано несколько различных парадигм количественной оценки. Например, некоторые исследовательские группы количественно оценивают нагрузку Aβ во всей интересующей области (кора или гиппокамп), в то время как другие количественно оценивают нагрузку Aβ в определенной подобласти интереса (часть коры или гиппокампа) 9,10,11. Хотя методы обнаружения и количественной оценки Aβ были хорошо установлены и задокументированы, о влиянии размера интересующей области на измерения нагрузки Aβ после иммуноокрашения не сообщалось. Таким образом, текущий протокол направлен на сравнение измерений нагрузки Aβ в полных и подрайонах, представляющих интерес, с использованием программного обеспечения для анализа изображений ImageJ.
В текущем исследовании использовались 13-месячные двойные трансгенные самцы мышей APP / PS1, которые экспрессируют химерную мышь / человека APP и мутантный пресенилин 1, для моделирования раннего начала AD12. Отложения Aβ начинают развиваться к 6-7-месячному возрасту, а обильное накопление Aβ наблюдается как в коре, так и в гиппокампе этих мышей к 9-10 месяцам12-летнего возраста. Трансгенные амилоидные пептиды и голопротеин могут быть обнаружены с помощью 6E10-иммуноокрашивания13, что делает его желательной моделью животного для настоящего протокола. Процедура, описанная в настоящем описании, включает подготовку ткани головного мозга, иммуноокрашивание свободно плавающих участков, визуализацию и количественную оценку нагрузки Aβ в полных по сравнению с субрегистраторами, представляющими интерес. Анализ показывает сильную корреляцию между полной и субрегиональной количественной оценкой, что указывает на надежное согласие между этими двумя методами в участках мозговой ткани, полученных от 13-месячных самцов мышей APP / PS1, которые показывают обильные отложения Aβ.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, описанный в настоящем описании, описывает процедуру подготовки геми-мозга к сагиттальному сечению, иммунофлуоресцентное окрашивание отложений Aβ с использованием антитела 6E10 на свободно плавающих участках, визуализацию окрашенных Aβ участков мозга с последующей количественной оценкой отложений Aβ в коре и гиппокампе ткани мозга мыши с использованием программного обеспечения для анализа изображений. Хотя существуют опубликованные протоколы для количественной оценки нагрузки Aβ в разделах 8,10 ткани мозга, этот протокол описывает этапы, участвующие в количественной оценке нагрузки Aβ во всей изокоре (называемой корой) и гиппокампе по сравнению с нагрузкой Aβ в подобласти, представляющей интерес в коре и гиппокампе, когда это может быть желательно. Также приведена корреляция между полным и субрегионами, представляющими интерес для анализа.
В протоколе есть несколько критических шагов. Во-первых, описанный протокол предназначен для участков мозговой ткани толщиной 20 мкм, подвергающихся свободно плавающему иммуноокрашиванию, что приводит к оптимальному проникновению антител в участок18 ткани. Метод свободного плавания может потребовать ручного переноса участков ткани между различными растворами во время иммунофлуоресцентного окрашивания и тщательного обращения с участками ткани на протяжении всей процедуры. Это особенно важно, когда участки ткани погружены в 70% раствор муравьиной кислоты для извлечения антигена в текущем протоколе, увеличивая хрупкость тканей для тонких участков. Альтернативные подходы к описанному протоколу включают использование более толстых участков ткани (например, 30-40 мкм) или использование участков ткани, которые непосредственно монтируются на положительно заряженные слайды перед иммунофлуоресцентным окрашиванием. Во-вторых, в протоколе, описанном в настоящем описании, используется флуоресцентно меченое антитело 6E10. Помимо использования флуоресцентно меченого антитела 6E10, нефлуоресцентные антитела 6E10 (например, конъюгированное антитело 6E10 с пероксидазой хрена) также могут быть использованы для обнаружения нагрузки Aβ в участках ткани мозга, и текущий протокол может быть адаптирован для количественной оценки Aβ-положительных иммунохимических пятен в участках ткани мозга, как описано ранее8 . В-третьих, точность результатов количественной оценки нагрузки Aβ будет зависеть от соответствующего порогового выбора в аналитическом программном обеспечении, которое зависит от фона ткани и интенсивности сигнала. Выбор порогового значения должен быть выполнен конечным пользователем таким образом, чтобы для количественной оценки отбирались только Aβ-положительные пятна. Вмешательство конечного пользователя требуется для оптимизации конкретного порогового значения, которое может быть применено ко всем изображениям для обеспечения точности установки порога. В-четвертых, поскольку анализ подрайона интереса требует выбора небольшой области интереса в тканевом разделе, для этого анализа были использованы два независимых читателя. Для сохранения независимости и ослепления во время сбора данных все изображения были закодированы номером; последовательность анализа изображений была рандомизирована между читателями таким образом, что разные читатели анализировали разные изображения в любой момент времени, и данные представлялись в конце каждой недели. В связи с повышенной вероятностью межсчитывающей изменчивости в области выбора интересующей области в анализе подрайон интереса, читатели были обучены с использованием нескольких образцов изображений для оптимизации выбора области в коре головного мозга и гиппокампе перед началом сбора данных. Это обучение имеет решающее значение для снижения вариабельности между читателями, и, как видно (рисунок 5A, B), положительная область 6E10, о которой сообщают оба читателя, показывает сильное относительное согласие в текущем исследовании.
Текущий протокол и результаты предоставляют ценную информацию о влиянии размера интересующей области на количественную оценку Aβ-положительной области. Ожидается, что большая область интереса будет представлять ткань больше, чем меньшая область интереса. Поэтому отбор проб более крупной ткани желателен для точной количественной оценки нагрузки Aβ в тканях. Однако в случае однородного распределения нагрузки Aβ внутри ткани меньшая область выборки обычно считается хорошим представлением более крупной исследуемой ткани. Текущие результаты исследования подтверждают это, и нагрузка Aβ во всей коре головного мозга и гиппокампе была сильным коррелятом нагрузки Aβ в выбранной подобласти коры и гиппокампа (рисунок 5C, D). Чтобы еще больше подтвердить согласие между полным и субрегистраторами, представляющими интерес, сравнивали среднюю 6E10-положительную область в коре головного мозга и гиппокампе, и не было обнаружено никакой разницы между двумя методами (рисунок 5E). Это подтверждает, что любой из этих методов (полный или субрегиональный анализ) дает сопоставимые измерения нагрузки Aβ.
Текущий протокол имеет некоторые ограничения. Эти два метода (анализ всего региона и субрегиона) не всегда могут использоваться взаимозаменяемо. Выбор использования полного или субрегионального анализа будет зависеть от регионального распределения Aβ в ткани, на которое влияет возраст, пол и штамм мышиной модели AD. Через 13 месяцев нагрузка Aβ распределяется по всей коре и гиппокампу мышей APP/PS1. Однако в 6 месяцев отложения Aβ ограничиваются корой, а минимальные отложения наблюдаются в гиппокампе12. В таких условиях анализ полной области интереса может быть желательным подходом для увеличения площади выборки ткани и, следовательно, сигнала Aβ. С другой стороны, анализ субрегион может быть методом выбора, когда нагрузка Aβ в определенной области мозга представляет интерес (например, соматосенсорная кора). Кроме того, через 13 месяцев самцы мышей APP/PS1 демонстрируют интенсивные 6E10-положительные пятна, а иммунофлуоресцентное окрашивание приводит к отличному сигналу с очень низким фоном, что делает текущий протокол очень подходящим для количественной оценки в данных условиях. Неясно, может ли этот метод количественной оценки быть успешно применен к менее интенсивному окрашиванию, и для ответа на этот вопрос потребуется будущая работа. Иммунофлуоресцентный способ количественной оценки и способ количественной оценки изображений, представленный в настоящем описании, обнаруживает все формы Aβ, включая форму предшественника13. В результате, если есть интерес к обнаружению конкретного вида Aβ (например, Aβ1-40 или Aβ1-42), могут быть использованы антитела, специфичные для этих изоформ Aβ. Поэтому, хотя метод иммунофлуоресцентного окрашивания и обнаружения 6E10 коррелировал с измерениями измерений Aβ1-42 в гомогенатах всего мозга с использованием ИФА (рисунок 5F, G), корреляция была лишь скромной. Это можно объяснить измерением только Aβ1-42 с использованием ИФА и обнаружением всех видов Aβ с использованием иммуноокрашивания 6E10. В настоящем исследовании используются три читателя для оценки согласия и корреляции между полным и субрегиональным анализом. Наличие дополнительных читателей может повысить надежность исследования и может дополнительно подтвердить соглашения между двумя методами, представленными здесь. Кроме того, мы используем корреляцию Пирсона в качестве меры согласия, которая широко используется среди других методов для описания согласия между непрерывными переменными19. Однако одним из ограничений использования корреляции Пирсона для определения согласия является то, что два способа, используемые в настоящем описании, могут давать связанные результаты, но один способ может привести к общим более высоким значениям, чем другой, из-за систематической предвзятости. Таким образом, корреляция Пирсона является хорошей мерой относительного согласия19. Для повышения надежности протокола могутбыть использованы дополнительные методы подтверждения абсолютного согласия, такие как сравнение средней 6E10-положительной области двумя методами (рисунок 5E). Взятый вместе, текущий протокол сравнивает нагрузку Aβ, обнаруженную иммунофлуоресцентным окрашиванием, и анализирует полные и субобласти, представляющие интерес в участках ткани мозга. Результаты показывают сильную корреляцию между этими двумя методами для участков мозговой ткани, полученных от 13-месячных самцов мышей APP / PS1, которые показывают обильные отложения Aβ.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследования, представленные в этой публикации, были поддержаны Национальным институтом старения Национальных институтов здравоохранения под номерами R01AG062840 (для RKS) и R01AG072896 (для RKS). Содержание является исключительной ответственностью авторов и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения. Около $200 тыс. (100%) федеральных средств поддержали этот проект. Мы также хотели бы поблагодарить д-ра Джошуа Яна за его помощь в редактировании рукописей.
Materials
| 15 mL conical tubes | ThermoFisher Scientific, MA, USA | 339650 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| 24-well plates | Fisher Scientific, NH, USA | FB012929 | https://www.fishersci.com/shop/products/jet-biofil-surface-treated-steriletissue-culture-plates-3/FB012929 |
| Amyloid beta 42 human ELISA kit | ThermoFisher Scientific, MA, USA | KHB3441 | https://www.thermofisher.com/elisa/product/Amyloid-beta-42-Human-ELISA-Kit/KHB3441 |
| Aqueous mounting media | Vector laboratories, CA, USA | H-5501-60 | https://vectorlabs.com/products/mounting/vectamount-aq-aqueous-mounting-medium |
| Bovine serum albumin | Sigmaaldrich, MO, USA | A2153-50G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/a2153?gclid=CjwKCAjw9aiIBhA1EiwAJ_G TSiZ9B3YGz3RvSpWqCH4CPW78 Dj4WlgxmzPs631z5IHmy5XLV TdC_jBoC9zQQAvD_BwE |
| BZ-X710 Keyence all-in-one fluorescence microscope | Keyence, IL, USA | BZ-X710 | https://www.keyence.com/products/microscope/fluorescence-microscope/bz-x700/models/bz-x710/ |
| Clear nail poilsh | User preference | NA | None |
| Cryostat | Leica Biosystems, IL, USA | Leica CM1860 Cryostat | https://www.leicabiosystems.com/us/histology-equipment/cryostats/leica-cm1860/ |
| Formic acid | Sigmaaldrich, MO, USA | F0507-500ML | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigald/f0507?gclid=CjwKCAjw9aiIBhA1EiwAJ_G TSheH6JMGnla50C3Ag0cLzXE8 BObxvDApl0udjYAPZmBGe7a 8PRUv1RoCt34QAvD_BwE |
| Glass coverslips | VWR, PA, USA | 48393-081 | https://us.vwr.com/store/product/4645817/vwr-micro-cover-glasses-rectangular |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, CA, USA | Version 8 | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
| ImageJ 1.51k | National Institutes of Health, MD, USA | Version 1.53e | https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| Mice | Jackson Laboratories, ME, USA | 034829-JAX | https://www.mmrrc.org/catalog/sds.php?mmrrc_id=34829 |
| Paraformaldehyde | Sigmaaldrich, MO, USA | P6148-500G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sial/p6148?gclid=CjwKCAjw9aiIBhA1EiwAJ_G TShtLb9Ax9MmRyrFn6Rfmmg 1l52_5XZFXOeXT24ik8Lkw GH7fvlDoHBoChzYQAvD_BwE |
| Phenytoin/pentobarbital based anesthetic (Euthasol) | Patterson Veterinary, MA, USA | 07-805-9296 | https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_32818 |
| Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific, NH, USA | BP661-50 | https://www.fishersci.com/shop/products/pbs-1x-powder-concentrate-white-granular-powder-fisher-bioreagents-2/BP66150 |
| Plus (+) microscope slides | Ted Pella, Inc., CA, USA | 260100 | https://www.tedpella.com/histo_html/slides.htm#260384 |
| Primary antibody (6E10) | Biolegend, CA, USA | 803013 | https://www.biolegend.com/en-us/products/alexa-fluor-488-anti-beta-amyloid-1-16-antibody-10833 |
| Sucrose | Sigmaaldrich, MO, USA | 47289 | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/supelco/47289?gclid=CjwKCAjw9aiIBhA1EiwAJ_ GTSuwlymWL_PUl2KIMHymi GLOWluZdPjf3pRcjMEjQD siItfWiG-C2-RoCxyoQAvD_BwE |
| Triton X 100 | Sigmaaldrich, MO, USA | T8787-100ML | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8787?context=product |
References
- Alzheimer’s Association. 2021 Alzheimer’s disease facts and figures. Alzheimer’s & Dementia. 17 (3), 327-406 (2021).
- Langa, K. M., Foster, N. L., Larson, E. B. Mixed dementia: emerging concepts and therapeutic implications. Journal of the American Medical Association. 292 (23), 2901-2908 (2004).
- Gandy, S., DeKosky, S. T. Toward the treatment and prevention of Alzheimer’s disease: rational strategies and recent progress. Annual Review of Medicine. 64, 367-383 (2013).
- Bloom, G. S. Amyloid-beta and tau: the trigger and bullet in Alzheimer disease pathogenesis. JAMA Neurology. 71 (4), 505-508 (2014).
- Gremer, L., et al. Fibril structure of amyloid-beta(1-42) by cryo-electron microscopy. Science. 358 (6359), 116-119 (2017).
- Ferrero, J., et al. First-in-human, double-blind, placebo-controlled, single-dose escalation study of aducanumab (BIIB037) in mild-to-moderate Alzheimer’s disease. Alzheimer’s & Dementia Translational Research & Clinical Interventions. 2 (3), 169-176 (2016).
- Poon, C. H., Wang, Y., Fung, M. L., Zhang, C., Lim, L. W. Rodent models of amyloid-beta feature of Alzheimer’s disease: development and potential treatment implications. Aging and Disease. 11 (5), 1235-1259 (2020).
- Christensen, A., Pike, C. J. Staining and quantification of beta-amyloid pathology in transgenic mouse models of Alzheimer’s disease. Methods in Molecular Biology. 2144, 221 (2020).
- Thakker, D. R., et al. Intracerebroventricular amyloid-beta antibodies reduce cerebral amyloid angiopathy and associated micro-hemorrhages in aged Tg2576 mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (11), 4501-4506 (2009).
- Song, Z., et al. Detecting amyloid-beta accumulation via immunofluorescent staining in a mouse model of Alzheimer’s disease. Journal of Visualized Experiments. (170), e62254 (2021).
- Sun, J., et al. Hematologic safety of chronic brain-penetrating erythropoietin dosing in APP/PS1 mice. Alzheimer’s & DementiaTranslational Research & Clinical Interventions. 5, 627-636 (2019).
- Jankowsky, J. L., et al. Mutant presenilins specifically elevate the levels of the 42 residue beta-amyloid peptide in vivo: evidence for augmentation of a 42-specific gamma secretase. Human Molecular Genetics. 13 (2), 159-170 (2004).
- Grant, M. K. O., et al. Human cerebrospinal fluid 6E10-immunoreactive protein species contain amyloid precursor protein fragments. PloS One. 14 (2), 0212815 (2019).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Eichenbaum, K. D., et al. Minimally invasive method for murine brain fixation. Biotechniques. 39 (4), 487-490 (2005).
- Chang, R., et al. Blood-brain barrier penetrating biologic tnf-alpha inhibitor for Alzheimer’s disease. Molecular Pharmaceutics. 14 (7), 2340-2349 (2017).
- Pinskiy, V., et al. High-throughput method of whole-brain sectioning, using the tape-transfer technique. PloS One. 10 (7), 0102363 (2015).
- Potts, E. M., Coppotelli, G., Ross, J. M. Histological-based stainings using free-floating tissue sections. Journal of Visualized Experiments. (162), e61622 (2020).
- van Stralen, K. J., Dekker, F. W., Zoccali, C., Jager, K. J. Measuring agreement, more complicated than it seems. Nephron Clinical Practice. 120 (3), 162-167 (2012).
