כימות מלא לעומת תת-אזורי של עומס עמילואיד-בטא על מקטעי מוח של עכבר
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר ומשווה את ההליך לביצוע ניתוח של אזור מלא או תת-אזור עניין של מקטעי מוח של עכברי sagittal כדי לכמת את עומס העמילואיד-בטא במודל העכבר המהונדס APP/PS1 של מחלת אלצהיימר.
Abstract
הצטברות חוץ-תאית של פלאקים עמילואיד-בטא (Aβ) היא אחד מסימני ההיכר הפתולוגיים העיקריים של מחלת האלצהיימר (AD), והיא היעד של הטיפול היחיד המשנה את המחלה שאושר על ידי ה-FDA עבור AD. בהתאם לכך, השימוש במודלים של עכברים מהונדסים המבטאים יתר על המידה את החלבון המבשר עמילואיד ובכך צוברים פלאקים Aβ מוחיים נמצאים בשימוש נרחב כדי לדגום AD אנושי בעכברים. לכן, בדיקות אימונואסאסאיות, כולל בדיקה חיסונית הקשורה לאנזים (ELISA) ו-immunostaining, מודדות בדרך כלל את עומס ה-Aβ ברקמות המוח שמקורן בעכברים מהונדסים של AD. אף על פי שהשיטות לזיהוי וכימות של Aβ מבוססות היטב ותועדו היטב, ההשפעה של גודל אזור העניין שנבחר ברקמת המוח על מדידות עומס Aβ לאחר שמירה חיסונית לא דווחה. לכן, הפרוטוקול הנוכחי נועד להשוות את מדידות העומס של Aβ על פני האזורים המלאים ותת-האזורים המעניינים באמצעות תוכנת ניתוח תמונה. השלבים המעורבים בהכנת רקמות מוח, חיטוי חיסוני של מקטעי מוח צפים בחופשיות, הדמיה וכימות של עומס Aβ באזורי משנה מלאים לעומת אזורי עניין מתוארים באמצעות מקטעי מוח הנגזרים מעכברים זכרים מהונדסים כפולה של APP/PS1 בני 13 חודשים. הפרוטוקול הנוכחי והתוצאות מספקים מידע רב ערך על ההשפעה של גודל אזור העניין על כימות אזור חיובי Aβ, ומראים מתאם חזק בין האזור החיובי Aβ המתקבל באמצעות ניתוחים מלאים ותת-אזורי עניין עבור מקטעי מוח הנגזרים מעכברי APP/PS1 זכרים בני 13 חודשים המראים תצהיר Aβ נרחב.
Introduction
מחלת האלצהיימר (AD), סיבת המוות השישית המובילה בארצות הברית, ממשיכה להוות איום על בריאות הציבור, עם כ-6.2 מיליון אמריקאים החיים עם אלצהיימר. זה צפוי להגיע ל-13.8 מיליון עד 20601. נכון להיום, ניהול סימפטומטי באמצעות תרופות כגון מעכבי כולינסטראז וממנטין הוא הקורס העיקרי של הטיפול2. AD מאופיין בביטויים נוירופתולוגיים כגון תצהיר חוץ-תאי של פלאקים עמילואיד-בטא (Aβ) והצטברות טאו היפר-פוספורית תוך-תאית בצורה של סבכים נוירו-פיברילריים 3,4. Aβ נוצר על ידי ביקוע אנדופרוטאוליטי של החלבון המבשר עמילואידי (APP) באמצעות בטא וגמא-סודאז, ומצטבר ליצירת אוליגומרים ופיברילים, מה שמוביל להשפעות נוירוטוקסיות5. ההשערה היא ש-Aβ ממלא תפקיד פתולוגי ראשוני מאז שנות ה-80 של המאה ה-20, והוא היעד הטיפולי של הטיפול היחיד בשינוי המחלה שאושר על ידי ה-FDA עבור AD6. כתוצאה מכך, מודלים מהונדסים של עכברי AD המכילים מוטציות בגנים וכתוצאה מכך הצטברות מוחית חזקה של Aβ היו בשימוש נרחב למחקר AD פרה-קליני מאז תחילת שנות ה-907.
זיהוי של מיני Aβ במוחות עכברים מהונדסים אלה של AD נעשה בדרך כלל באמצעות שני מבחנים חיסוניים: בדיקה חיסונית הקשורה לאנזים (ELISA) ושמירה חיסונית. הבדיקה הראשונה מאפשרת קביעה כמותית של מיני Aβ שונים והיא גוזלת פחות זמן בהשוואה לתפיסת חיסון, הדורשת מספר שלבי עיבוד והדמיה רציפים של רקמות, כולל חתך רקמות, חיסון, הדמיה וכימות8. יתר על כן, התוצאות המתקבלות לאחר חיסון הם כמותיים למחצה8. עם זאת, היכולת למקם את Aβ באופן מרחבי הופכת את החיסון לגישה אטרקטיבית לזיהוי Aβ ברקמות המוח8.
בעת השימוש ב-Aβ immunostaining, מספר פרדיגמות כימות שונות שימשו קבוצות מחקר שונות. לדוגמה, קבוצות מחקר מסוימות מכמתות את עומס ה-Aβ בכל אזור העניין (קליפת המוח או ההיפוקמפוס), בעוד שאחרות מכמתות את עומס ה-Aβ בתת-אזור מסוים של עניין (חלק מקליפת המוח או ההיפוקמפוס)9,10,11. אף על פי שהשיטות לזיהוי וכימות Aβ היו מבוססות ומתועדות היטב, ההשפעה של גודל אזור העניין על מדידות עומס Aβ בעקבות חיסון לא דווחה. לכן, הפרוטוקול הנוכחי נועד להשוות את מדידות העומס של Aβ על פני אזורי העניין המלאים ותת-האזורים המעניינים באמצעות תוכנת ניתוח תמונה, ImageJ.
המחקר הנוכחי השתמש בעכברים זכרים מהונדסים כפולים של APP/PS1 בני 13 חודשים, המבטאים אפליקציה של עכבר/אדם כימרי ופרזנילין 1 מוטנטי, כדי לדגום הופעה מוקדמת של12 לספירה. מרבצי Aβ מתחילים להתפתח בגיל 6-7 חודשים, והצטברות Aβ שופעת נצפית הן בקליפת המוח והן בהיפוקמפוס של עכברים אלה עד גיל 9-10 חודשים בגיל12. ניתן לזהות את פפטידי העמילואיד המהונדסים וההולופרוטאין על ידי 6E10-immunostaining13, מה שהופך אותו למודל חייתי רצוי לפרוטוקול הנוכחי. ההליך הנדון כאן כולל הכנת רקמות מוח, חיסון של מקטעים צפים חופשיים, הדמיה וכימות של עומס Aβ באזורי עניין מלאים לעומת תתי-תחומי עניין. הניתוח מראה מתאם חזק בין הכימות המלא והתת-אזורי, מה שמצביע על הסכמה איתנה בין שתי השיטות הללו בקטעי רקמת המוח הנגזרים מעכברי זכרי APP/PS1 בני 13 חודשים שמראים שפע של משקעי Aβ.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן מתווה את ההליך להכנת המוח ההמי לחתך סגיטלי, צביעה אימונופלואורסצנטית של מרבצי Aβ באמצעות הנוגדן 6E10 על מקטעים צפים חופשיים, הדמיה של מקטעי המוח המוכתמים ב-Aβ ולאחר מכן כימות של משקעי Aβ בקליפת המוח וההיפוקמפוס של רקמת המוח של העכבר באמצעות תוכנה לניתוח תמונות. אמנם ישנם פרוטוקולים שפורסמו לכימות עומס Aβ בקטעים של רקמת המוח 8,10, אך פרוטוקול זה מתאר את השלבים המעורבים בכימות עומס Aβ בכל האיזו-קליפת המוח (המכונה קליפת המוח) ובהיפוקמפוס בהשוואה לעומס Aβ בתת-אזור בעל עניין בקליפת המוח ובהיפוקמפוס, כאשר הדבר עשוי להיות רצוי. ניתן גם המתאם בין תתי-האזורים המלאים לעומת תתי-האזורים של ניתוחי העניין.
ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול. ראשית, הפרוטוקול המתואר הוא עבור מקטעי רקמת מוח בעובי 20 מיקרומטר הנתונים לתכשיר חיסוני צף חופשי, מה שמביא לחדירת נוגדנים אופטימלית בתוך מקטע הרקמה18. טכניקת הציפה החופשית עשויה לדרוש את העברתם של חלקי הרקמה באופן ידני בין התמיסות השונות במהלך הכתם החיסוני, וטיפול זהיר בחתכי הרקמה לאורך ההליך. זה חיוני במיוחד כאשר חלקי הרקמה שקועים בתמיסת החומצה הפורמית של 70% לאחזור אנטיגן בפרוטוקול הנוכחי, מה שמגדיל את שבירת הרקמות עבור חלקים דקים. גישות חלופיות לפרוטוקול המתואר כוללות שימוש בחתכי רקמה עבים יותר (למשל, 30-40 מיקרומטר) או שימוש בקטעי רקמה המותקנים ישירות על שקופיות טעונות חיובית לפני הכתם האימונופלואורסצנטי. שנית, הפרוטוקול המתואר כאן משתמש בנוגדן 6E10 בעל תווית פלואורסצנטית. מלבד השימוש בנוגדן 6E10 בעל התווית הפלואורסצנטית, ניתן להשתמש גם בנוגדנים 6E10 שאינם פלואורסצנטיים (למשל, נוגדן 6E10 מצומד ל-Aβ) שאינם פלואורסצנטיים (לדוגמה, נוגדן 6E10 מצומד ל-Aβ- peroxidase) כדי לזהות עומס Aβ בחתכי רקמת המוח כפי שתואר קודם לכן8 . שלישית, הדיוק של התוצאות עבור כימות עומס Aβ יהיה תלוי בבחירת הסף המתאימה בתוכנת הניתוח, התלויה ברקע הרקמה ובעוצמת האות. בחירת הסף חייבת להתבצע על ידי משתמש הקצה כך שרק כתמים חיוביים של Aβ ייבחרו לכימות. נדרשת התערבות של משתמש קצה כדי למטב את הסף הספציפי שניתן להחיל על כל התמונות כדי להבטיח את הדיוק של הגדרת הסף. רביעית, מכיוון שתת-אזור ניתוח העניין דורש בחירת אזור עניין קטן במדור הרקמות, נעשה שימוש בשני קוראים עצמאיים לניתוח זה. כדי לשמור על עצמאות וסנוור במהלך איסוף הנתונים, כל התמונות היו מקודדות במספרים; רצף ניתוח התמונות היה אקראי בין הקוראים כך שהקוראים השונים ניתחו תמונות שונות בכל זמן נתון, והנתונים הוגשו בסוף כל שבוע. בשל הסבירות המוגברת לשונות בין קוראים באזור בחירת העניין בתת-אזור ניתוח העניין, הקוראים אומנו באמצעות מספר תמונות מדגם כדי לייעל את בחירת האזור בקליפת המוח ובהיפוקמפוס לפני תחילת איסוף הנתונים. אימון זה חיוני כדי להפחית את השונות בין הקוראים, וכפי שניתן לראות (איור 5A,B), האזור החיובי 6E10 שדווח על ידי שני הקוראים מראה הסכמה יחסית חזקה במחקר הנוכחי.
הפרוטוקול הנוכחי והתוצאות מספקים מידע רב ערך על ההשפעה של אזור גודל העניין על כימות שטח חיובי Aβ. אזור עניין גדול יותר צפוי לייצג את הרקמה יותר מאשר אזור עניין קטן יותר. לכן, דגימת רקמה גדולה יותר רצויה כדי לכמת במדויק את עומס Aβ ברקמות. עם זאת, במקרה של התפלגות עומס Aβ הומוגנית בתוך הרקמה, אזור דגימה קטן יותר נחשב בדרך כלל לייצוג טוב של הרקמה הגדולה יותר תחת ניתוח. תוצאות המחקר הנוכחיות מאשרות זאת, ועומס ה-Aβ בכל קליפת המוח ובהיפוקמפוס היה מתאם חזק של עומס Aβ בתת-אזור נבחר של קליפת המוח ובהיפוקמפוס (איור 5C,D). כדי לאשש עוד יותר את ההסכמה בין ניתוחי העניין המלאים ותת-האזורים, הושוו האזור החיובי הממוצע של 6E10 בקליפת המוח ובהיפוקמפוס, ולא נמצא הבדל בין שתי השיטות (איור 5E). זה מאשר שאחת מהשיטות הללו (ניתוח מלא או תת-אזור) מניבה מדידות עומס Aβ דומות.
לפרוטוקול הנוכחי יש כמה מגבלות. שתי השיטות (ניתוח אזור מלא לעומת ניתוח תת-אזור) לא תמיד ישמשו לסירוגין. הבחירה בשימוש בניתוח מלא או תת-אזור תהיה תלויה בהתפלגות האזורית של Aβ בתוך הרקמה, המושפעת מהגיל, המין והמתח של מודל העכבר AD. בגיל 13 חודשים, עומס ה-Aβ מופץ בכל קליפת המוח וההיפוקמפוס של עכברי ה-APP/PS1. עם זאת, לאחר 6 חודשים, מרבצי Aβ מוגבלים לקליפת המוח, ומשקעים מינימליים נצפים בהיפוקמפוס12. בתנאים כאלה, האזור המלא של ניתוח העניין עשוי להיות הגישה הרצויה להגדלת אזור דגימת הרקמה ובכך האות Aβ. מצד שני, ניתוח תת-אזור עשוי להיות השיטה המועדפת כאשר עומס Aβ באזור מסוים במוח הוא בעל עניין, (למשל, קליפת המוח הסומטוסנסורית). בנוסף, בגיל 13 חודשים, העכברים הזכרים של APP/PS1 מדגימים כתמים חיוביים עזים של 6E10, והכתם האימונופלואורסצנטי גורם לאות מצוין עם רקע נמוך מאוד, מה שהופך את הפרוטוקול הנוכחי למתאים מאוד לכימות בתנאים הנתונים. לא ברור אם ניתן ליישם בהצלחה את שיטת הכימות הזו על כתמים פחות עזים, ויידרשו עבודות עתידיות כדי לענות על שאלה זו. שיטת הכימות האימונופלואורסצנטית והתמונה המוצגת כאן מזהה את כל הצורות של Aβ, כולל הצורה המקדימה13. כתוצאה מכך, אם יש עניין בזיהוי של Aβ specie ספציפי (למשל, Aβ1-40 או Aβ1-42), ניתן להשתמש בנוגדנים ספציפיים לאיזופורמים אלה של Aβ. לכן, אף על פי ששיטת הכתמים והזיהוי החיסוניים 6E10 תאמה את המדידות של מדידות Aβ1-42 בהומוגנאטים של מוח שלם באמצעות ELISA (איור 5F,G), המתאם היה צנוע בלבד. ניתן לייחס זאת למדידה של Aβ1-42 בלבד באמצעות ELISA ולזיהוי של כל מיני Aβ באמצעות 6E10 immunostaining. המחקר הנוכחי משתמש בשלושה קוראים כדי להעריך את ההסכמה והמתאם בין הניתוח המלא והתת-אזורי. קיום קוראים נוספים עשוי לשפר את חוסנו של המחקר ויכול לאמת עוד יותר את ההסכמים בין שתי השיטות שהוצגו כאן. יתר על כן, אנו משתמשים בקורלציה של פירסון כמדד להסכמה, אשר נמצא בשימוש נרחב בין שיטות אחרות כדי לתאר את ההסכם בין משתנים רציפים19. עם זאת, מגבלה אחת של שימוש בקורלציה של פירסון כדי לקבוע הסכמה היא ששתי השיטות המשמשות כאן עשויות לספק תוצאות קשורות, אך שיטה אחת עלולה לגרום לערכים גבוהים יותר מהשנייה בשל הטיה שיטתית. לכן, מתאם פירסון הוא מדד טוב להסכמה יחסית19. כדי להגביר את החוסן של הפרוטוקול, ניתן להשתמש בשיטות נוספות לאישור ההסכם המוחלט, כגון השוואת השטח החיובי הממוצע של 6E10 על ידי שתי השיטות (איור 5E),19. יחד, הפרוטוקול הנוכחי משווה את עומס ה-Aβ שזוהה על ידי צביעה אימונופלואורסצנטית ומנתח את האזורים המלאים ותת-האזורים המעניינים בקטעי רקמת המוח. התוצאות מראות מתאם חזק בין שתי השיטות הללו עבור מקטעי רקמת מוח שמקורם בעכברים זכרים בני 13 חודשים של APP/PS1, שמראים שפע של משקעי Aβ.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי להזדקנות של המכונים הלאומיים לבריאות תחת מספרי הפרס R01AG062840 (ל- RKS) ו- R01AG072896 (ל- RKS). התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות. כ-200 אלף דולר (100%) מהקרנות הפדרליות תמכו בפרויקט זה. ברצוננו להודות גם לד”ר ג’ושוע יאנג על עזרתו בעריכת כתבי יד.
Materials
| 15 mL conical tubes | ThermoFisher Scientific, MA, USA | 339650 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| 24-well plates | Fisher Scientific, NH, USA | FB012929 | https://www.fishersci.com/shop/products/jet-biofil-surface-treated-steriletissue-culture-plates-3/FB012929 |
| Amyloid beta 42 human ELISA kit | ThermoFisher Scientific, MA, USA | KHB3441 | https://www.thermofisher.com/elisa/product/Amyloid-beta-42-Human-ELISA-Kit/KHB3441 |
| Aqueous mounting media | Vector laboratories, CA, USA | H-5501-60 | https://vectorlabs.com/products/mounting/vectamount-aq-aqueous-mounting-medium |
| Bovine serum albumin | Sigmaaldrich, MO, USA | A2153-50G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/a2153?gclid=CjwKCAjw9aiIBhA1EiwAJ_G TSiZ9B3YGz3RvSpWqCH4CPW78 Dj4WlgxmzPs631z5IHmy5XLV TdC_jBoC9zQQAvD_BwE |
| BZ-X710 Keyence all-in-one fluorescence microscope | Keyence, IL, USA | BZ-X710 | https://www.keyence.com/products/microscope/fluorescence-microscope/bz-x700/models/bz-x710/ |
| Clear nail poilsh | User preference | NA | None |
| Cryostat | Leica Biosystems, IL, USA | Leica CM1860 Cryostat | https://www.leicabiosystems.com/us/histology-equipment/cryostats/leica-cm1860/ |
| Formic acid | Sigmaaldrich, MO, USA | F0507-500ML | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigald/f0507?gclid=CjwKCAjw9aiIBhA1EiwAJ_G TSheH6JMGnla50C3Ag0cLzXE8 BObxvDApl0udjYAPZmBGe7a 8PRUv1RoCt34QAvD_BwE |
| Glass coverslips | VWR, PA, USA | 48393-081 | https://us.vwr.com/store/product/4645817/vwr-micro-cover-glasses-rectangular |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, CA, USA | Version 8 | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
| ImageJ 1.51k | National Institutes of Health, MD, USA | Version 1.53e | https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| Mice | Jackson Laboratories, ME, USA | 034829-JAX | https://www.mmrrc.org/catalog/sds.php?mmrrc_id=34829 |
| Paraformaldehyde | Sigmaaldrich, MO, USA | P6148-500G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sial/p6148?gclid=CjwKCAjw9aiIBhA1EiwAJ_G TShtLb9Ax9MmRyrFn6Rfmmg 1l52_5XZFXOeXT24ik8Lkw GH7fvlDoHBoChzYQAvD_BwE |
| Phenytoin/pentobarbital based anesthetic (Euthasol) | Patterson Veterinary, MA, USA | 07-805-9296 | https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_32818 |
| Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific, NH, USA | BP661-50 | https://www.fishersci.com/shop/products/pbs-1x-powder-concentrate-white-granular-powder-fisher-bioreagents-2/BP66150 |
| Plus (+) microscope slides | Ted Pella, Inc., CA, USA | 260100 | https://www.tedpella.com/histo_html/slides.htm#260384 |
| Primary antibody (6E10) | Biolegend, CA, USA | 803013 | https://www.biolegend.com/en-us/products/alexa-fluor-488-anti-beta-amyloid-1-16-antibody-10833 |
| Sucrose | Sigmaaldrich, MO, USA | 47289 | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/supelco/47289?gclid=CjwKCAjw9aiIBhA1EiwAJ_ GTSuwlymWL_PUl2KIMHymi GLOWluZdPjf3pRcjMEjQD siItfWiG-C2-RoCxyoQAvD_BwE |
| Triton X 100 | Sigmaaldrich, MO, USA | T8787-100ML | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8787?context=product |
References
- Alzheimer’s Association. 2021 Alzheimer’s disease facts and figures. Alzheimer’s & Dementia. 17 (3), 327-406 (2021).
- Langa, K. M., Foster, N. L., Larson, E. B. Mixed dementia: emerging concepts and therapeutic implications. Journal of the American Medical Association. 292 (23), 2901-2908 (2004).
- Gandy, S., DeKosky, S. T. Toward the treatment and prevention of Alzheimer’s disease: rational strategies and recent progress. Annual Review of Medicine. 64, 367-383 (2013).
- Bloom, G. S. Amyloid-beta and tau: the trigger and bullet in Alzheimer disease pathogenesis. JAMA Neurology. 71 (4), 505-508 (2014).
- Gremer, L., et al. Fibril structure of amyloid-beta(1-42) by cryo-electron microscopy. Science. 358 (6359), 116-119 (2017).
- Ferrero, J., et al. First-in-human, double-blind, placebo-controlled, single-dose escalation study of aducanumab (BIIB037) in mild-to-moderate Alzheimer’s disease. Alzheimer’s & Dementia Translational Research & Clinical Interventions. 2 (3), 169-176 (2016).
- Poon, C. H., Wang, Y., Fung, M. L., Zhang, C., Lim, L. W. Rodent models of amyloid-beta feature of Alzheimer’s disease: development and potential treatment implications. Aging and Disease. 11 (5), 1235-1259 (2020).
- Christensen, A., Pike, C. J. Staining and quantification of beta-amyloid pathology in transgenic mouse models of Alzheimer’s disease. Methods in Molecular Biology. 2144, 221 (2020).
- Thakker, D. R., et al. Intracerebroventricular amyloid-beta antibodies reduce cerebral amyloid angiopathy and associated micro-hemorrhages in aged Tg2576 mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (11), 4501-4506 (2009).
- Song, Z., et al. Detecting amyloid-beta accumulation via immunofluorescent staining in a mouse model of Alzheimer’s disease. Journal of Visualized Experiments. (170), e62254 (2021).
- Sun, J., et al. Hematologic safety of chronic brain-penetrating erythropoietin dosing in APP/PS1 mice. Alzheimer’s & DementiaTranslational Research & Clinical Interventions. 5, 627-636 (2019).
- Jankowsky, J. L., et al. Mutant presenilins specifically elevate the levels of the 42 residue beta-amyloid peptide in vivo: evidence for augmentation of a 42-specific gamma secretase. Human Molecular Genetics. 13 (2), 159-170 (2004).
- Grant, M. K. O., et al. Human cerebrospinal fluid 6E10-immunoreactive protein species contain amyloid precursor protein fragments. PloS One. 14 (2), 0212815 (2019).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Eichenbaum, K. D., et al. Minimally invasive method for murine brain fixation. Biotechniques. 39 (4), 487-490 (2005).
- Chang, R., et al. Blood-brain barrier penetrating biologic tnf-alpha inhibitor for Alzheimer’s disease. Molecular Pharmaceutics. 14 (7), 2340-2349 (2017).
- Pinskiy, V., et al. High-throughput method of whole-brain sectioning, using the tape-transfer technique. PloS One. 10 (7), 0102363 (2015).
- Potts, E. M., Coppotelli, G., Ross, J. M. Histological-based stainings using free-floating tissue sections. Journal of Visualized Experiments. (162), e61622 (2020).
- van Stralen, K. J., Dekker, F. W., Zoccali, C., Jager, K. J. Measuring agreement, more complicated than it seems. Nephron Clinical Practice. 120 (3), 162-167 (2012).
