Culturas celulares primárias para estudar o potencial de regeneração de Murine Müller Glia após tratamento de MicroRNA

A glia Müller (MG) é a glia predominante na retina neural. Eles têm funções semelhantes em comparação com outras glia em outras partes do sistema nervoso central, como manter a água e a homeostase de íon, nutrir neurônios e proteger o tecido. Mg tem outra característica fascinante: embora sejam glia maduras, elas ainda expressam muitos genes expressos em células progenitoras de retina (RPCs) durante o desenvolvimento tardio ^1,2. Essa semelhança é considerada a razão para a regeneração neuronal baseada em MG na retina do peixe após danos na retina ^3,4. Durante esse processo, a MG reentra no ciclo celular e se desfastou em RPCs que, em seguida, se diferenciam em todos os seis tipos de neurônios da retina. Embora este fenômeno ocorra naturalmente em peixes, os mamíferos MG não se convertem em neurônios ^5,6. Eles podem, no entanto, ser reprogramados. Uma variedade de fatores tem sido mostrado para reprogramar MG em RPCs/neurônios; entre esses fatores está o fator básico de transcrição helix-loop-helix (bHLH) que está envolvido na regeneração de ^{peixes 7,8}. Em camundongos, Ascl1 só é expresso em RPCs durante a retinogênese, mas está ausente em MG maduro ou neurônios de retina⁹.

A reprogramação de células diretamente in vivo não só é metodologicamente desafiadora, mas também requer a aprovação de um comitê institucional de cuidados e uso de animais. Para receber aprovação, são necessários dados preliminares sobre os fatores usados ou alterados, concentrações, efeitos fora do alvo, mecanismos subjacentes, toxicidade e eficiência. Os sistemas de cultura celular permitem testes para esses critérios antes do uso em modelos in vivo. Além disso, como MG compreende apenas cerca de 5% de toda a população de células da retina¹⁰, as culturas de MG permitem o estudo de sua função¹¹, bem como seu comportamento, incluindo migração^12,13, proliferação¹⁴, reação de estresse a lesões/danos^15,16, sua interação com outros tipos celulares como microglia¹⁷ ou células de gânglios de retina (RGCs)¹⁸, ou seu potencial neurogênico 19,20,21. Muitos pesquisadores usam linhas celulares imortalizadas para seus estudos, pois têm um potencial proliferativo ilimitado e podem ser facilmente mantidas e transfetizadas. As células primárias, no entanto, são preferíveis para ensaios biologicamente relevantes do que células imortalizadas, pois possuem características celulares verdadeiras (expressão genética e proteica) e, mais importante, representam um certo estágio no desenvolvimento e, portanto, têm uma “idade”. A idade de um animal (e consequentemente das células obtidas de um animal) é um fator especialmente crucial na reprogramação celular, uma vez que a plasticidade celular reduz com o estágio de desenvolvimento^{progredido 22}.

Este protocolo descreve em detalhes como reprogramar MG primário com miRNAs como um método in vitro atual para estudar a regeneração. Este modelo de cultura primária de MG foi criado em 2012 para avaliar as características de proliferação celular de MG em camundongos knock-out P53 (trp53-/- camundongos)²³. Mostrou-se que mg cultivados mantêm suas características gliais (ou seja, expressão de proteínas S100β, Pax6 e Sox2 avaliadas via rotulagem imunofluorescente), e que se assemelham a in vivo MG (microarray de FACS-purificado MG)²³. Pouco depois, mRNA glial e expressão proteica foram validados e confirmados em uma abordagem diferente utilizando vetores virais²⁰. Alguns anos depois, foi confirmado que a grande maioria das células encontradas nessas culturas são MG usando o Rlbp1^CreERT:tdTomato^STOPfl/fl reporter mouse²⁴. Além disso, a quantificação do conjunto de miRNAs tanto em MG purificada facs quanto em MG primária cultivada mostrou que os níveis de MG miRNAs (mGLiomiRs) não variam muito em MG cultivada durante a fase de crescimento. Períodos de cultura alongados, no entanto, causam alterações nos níveis de miRNA e, consequentemente, nos níveis de mRNA e expressão proteica, uma vez que os miRNAs são reguladores translacionais²⁵.

Em 2013, este modelo de cultura mg foi utilizado para testar uma variedade de fatores de transcrição no que diz respeito à sua capacidade de reprogramar MG em neurônios^{retinais 20}. O Ascl1 foi considerado um fator de reprogramação muito robusto e confiável. A superexpressão de Ascl1 através de vetores virais induziu alterações morfológicas, expressão de marcadores neuronais e aquisição de propriedades eletrofisiológicas neuronais. Mais importante, os insights e resultados obtidos a partir desses primeiros experimentos in vitro foram transferidos com sucesso para aplicações in vivo ^22,26 demonstrando que as culturas primárias de MG representam uma ferramenta sólida e confiável para triagens iniciais de fatores e avaliação de recursos gliais antes da implementação in vivo.

Alguns anos atrás, foi mostrado que o miRNA miR-124 enriquecido pelo cérebro, que também é altamente expresso em neurônios da retina, pode induzir a expressão Ascl1 em MG²¹ cultivada. A expressão ascl1 em células vivas foi visualizada através de um rato repórter Ascl1 (Ascl1^CreERT:tdTomato^STOPfl/fl). Um rato repórter é um rato geneticamente modificado que tem um gene repórter inserido em seu DNA. Este gene repórter codifica uma proteína repórter, que está neste estudo tdTomato, uma proteína fluorescente vermelha. Esta proteína repórter relata a expressão de um gene de interesse, neste caso, Ascl1. Em outras palavras, as células que expressam Ascl1 ficarão vermelhas. Uma vez que o Ascl1 é expresso apenas em RPCs⁹, este rato Ascl1^CreERT:tdTomato^STOPfl/fl permite o rastreamento da conversão de MG em RPCs expressos ascl1 , o que significa que as células de conversão expressarão proteína de repórter tdTomato fluorescente vermelho. Esta é uma rotulagem irreversível, já que o DNA dessas células é alterado. Consequentemente, qualquer diferenciação neuronal subsequente será visualizada porque o rótulo tdTomato permanece em células diferenciadoras. Se ascl1 expressando RPCs derivados de MG (com rótulo tdTomato) se diferenciarem em neurônios, esses neurônios ainda terão seu rótulo vermelho. Este mouse, portanto, permite não apenas a rotulagem de RPCs derivados de MG para imagens de células vivas, mas também permite mapeamento de destino e rastreamento de linhagem desses RPCs derivados de MG (vermelho). Mais recentemente, o conjunto de miRNAs em RPCs foi identificado e as culturas mg de ratos Ascl1^CreERT:tdTomato^STOPfl/fl RPC-reporter foram usadas para tela e teste o efeito desses miRNAs na capacidade de reprogramação e eficiência²⁷. Um candidato, o RPC-miRNA miR-25, foi encontrado capaz de reprogramar MG cultivado em células expressantes Ascl1 (Ascl1-Tomate+). Essas células reprogramadas adotam características neuronais ao longo do tempo, incluindo morfologia neuronal (pequeno somata e processos finos curtos ou longos), expressão de transcrições neuronais medidas via scRNA-Seq, bem como expressão de proteínas neuronais validadas via rotulagem imunofluorescente²⁷.

Aqui, o protocolo detalha como crescer e transfectar MG a partir de camundongos P12 adaptados do trabalho anterior 21,24,27. Escolhido para este protocolo é o miRNA miR-25 acima mencionado, um miRNA altamente expresso em RPCs, com baixos níveis de expressão em MG ou neurônios de retina. Para superexpressar o miR-25, são utilizadas mímicas de murine miR-25, ou seja, moléculas artificiais de miRNA. Como controle, são escolhidas imitações de um miRNA de caenorhabditis elegans, que não têm função em células de mamíferos. A visualização da conversão de MG em RPCs foi realizada através do mouse repórter RPC (Ascl1^CreERT:tdTomato^STOPfl/fl), um mouse com fundo misto (cepas C57BL/6, S129 e ICR). Essa cultura pode, no entanto, ser realizada com todas as cepas de camundongos, incluindo cepas do tipo selvagem. Nos últimos anos, o protocolo original foi modificado para reduzir a duração da fase de crescimento e o período de cultura geral e garantir um status celular glia mais robusto e minimizar o grau de degeneração celular, que ocorre em períodos de cultura prolongada. O horário regular de transfecção também foi estendido de 3h para 2 dias. Como mencionado anteriormente, embora o protocolo atual descreva as culturas de MG como uma ferramenta para estudos de regeneração, o método não é apenas útil para testar fatores de reprogramação, mas também pode ser adaptado para outras aplicações, incluindo estudos sobre comportamento migratório ou proliferativo de MG, paradigmas relacionados a lesões/danos celulares e/ou a identificação de mecanismos e caminhos subjacentes.