Cultivos celulares primarios para estudiar el potencial de regeneración de la glía murina de Müller después del tratamiento con microARN

La glía de Müller (MG) es la glía predominante en la retina neural. Tienen funciones similares en comparación con otras glías en otras partes del sistema nervioso central, como mantener la homeostasis del agua y los iones, nutrir las neuronas y proteger el tejido. Las MG tienen otra característica fascinante: aunque son glía madura, todavía expresan muchos genes expresados en células progenitoras de la retina (RPC) durante el desarrollo tardío ^1,2. Se supone que esta semejanza es la razón de la regeneración neuronal natural basada en MG en la retina de los peces después del daño retiniano ^3,4. Durante este proceso, la MG vuelve a entrar en el ciclo celular y se desdiferencia en RPC que luego se diferencian en los seis tipos de neuronas retinianas. Aunque este fenómeno ocurre naturalmente en los peces, las MG de mamíferos no se convierten en neuronas ^5,6. Sin embargo, pueden reprogramarse. Se ha demostrado que una variedad de factores reprograman la MG en RPC/neuronas; entre estos factores se encuentra el factor de transcripción básico hélice-bucle-hélice (bHLH) homólogo 1 (Ascl1) que interviene en la regeneración de peces ^7,8. En ratones, Ascl1 solo se expresa en RPC durante la retinogénesis, pero está ausente en neuronas maduras mg o retinianas⁹.

La reprogramación de células directamente in vivo no solo es un desafío metodológico, sino que también requiere la aprobación de un comité institucional de cuidado y uso de animales. Para recibir la aprobación, se requieren datos preliminares sobre los factores utilizados o alterados, las concentraciones, los efectos fuera del objetivo, los mecanismos subyacentes, la toxicidad y la eficiencia. Los sistemas de cultivo celular permiten probar estos criterios antes de su uso en modelos in vivo. Además, dado que la MG solo comprende alrededor del 5% de toda la población de células retinianas¹⁰, los cultivos de MG permiten estudiar su función¹¹ así como su comportamiento, incluyendo la migración ^12,13, la proliferación¹⁴, la reacción al estrés ante una lesión/daño ^15,16, su interacción con otros tipos celulares como la microglía¹⁷ o las células ganglionares de la retina (RGC)¹⁸, o su potencial neurogénico 19,20,21. Muchos investigadores utilizan líneas celulares inmortalizadas para sus estudios, ya que tienen un potencial proliferativo ilimitado y pueden mantenerse y transfectarse fácilmente. Las células primarias, sin embargo, son preferibles para ensayos biológicamente relevantes que las células inmortalizadas, ya que tienen verdaderas características celulares (expresión de genes y proteínas) y, lo que es más importante, representan una cierta etapa en el desarrollo y, por lo tanto, tienen una “edad”. La edad de un animal (y en consecuencia de las células obtenidas de un animal) es un factor especialmente crucial en la reprogramación celular, ya que la plasticidad celular se reduce con la etapa avanzada de desarrollo²².

Este protocolo describe en detalle cómo reprogramar la MG primaria con miRNAs como un método in vitro actual para estudiar la regeneración. Este modelo de cultivo primario de MG se estableció en 2012 para evaluar las características de proliferación celular de MG en ratones knock-out P53 (ratones trp53-/-)²³. Se demostró que la MG cultivada mantiene sus características gliales (es decir, la expresión de las proteínas S100β, Pax6 y Sox2 evaluadas mediante el etiquetado inmunofluorescente), y que se asemejan a la MG in vivo (microarray de MG purificada por FACS)²³. Poco después, la expresión de ARNm glial y proteínas fue validada y confirmada en un enfoque diferente utilizando vectores virales²⁰. Unos años más tarde, se confirmó que la gran mayoría de las células encontradas en estos cultivos son MG mediante el uso del Rlbp1 específico de MG^CreERT:tdTomato^STOPfl/fl reporter mouse²⁴. Además, la cuantificación del conjunto de miRNAs tanto en MG purificada por FACS como en MG primaria cultivada mostró que los niveles de mg miRNAs (mGLiomiRs) no varían mucho en MG cultivada durante la fase de crecimiento. Los períodos de cultivo alargados, sin embargo, causan cambios en los niveles de miRNA y, en consecuencia, en los niveles de ARNm y la expresión de proteínas, ya que los miRNAs son reguladores traslacionales²⁵.

En 2013, este modelo de cultivo de MG se utilizó para probar una variedad de factores de transcripción con respecto a su capacidad para reprogramar MG en neuronas retinianas²⁰. Se encontró que Ascl1 era un factor de reprogramación muy robusto y confiable. La sobreexpresión de Ascl1 a través de vectores virales indujo cambios morfológicos, expresión de marcadores neuronales y la adquisición de propiedades electrofisiológicas neuronales. Más importante aún, los conocimientos y resultados obtenidos de estos primeros experimentos in vitro se transfirieron con éxito a aplicaciones in vivo ^22,26 demostrando que los cultivos primarios de MG representan una herramienta sólida y confiable para el cribado factorial inicial y la evaluación de las características gliales antes de la implementación in vivo.

Hace unos años, se demostró que el miRNA miR-124 enriquecido con cerebro, que también está altamente expresado en las neuronas de la retina, puede inducir la expresión de Ascl1 en MG²¹ cultivado. La expresión de Ascl1 en células vivas se visualizó a través de un ratón reportero Ascl1 (Ascl1^CreERT:tdTomato^STOPfl/fl). Un ratón reportero es un ratón genéticamente modificado que tiene un gen reportero insertado en su ADN. Este gen reportero codifica para una proteína reportera, que es en este estudio tdTomato, una proteína fluorescente roja. Esta proteína reportera informa de la expresión de un gen de interés, en este caso, Ascl1. En otras palabras, las células que expresan Ascl1 se volverán rojas. Dado que Ascl1 solo se expresa en RPC⁹, este ratón Ascl1^CreERT: tdTomato^{STOPfl / fl} permite el seguimiento de la conversión de MG en RPC que expresan Ascl1, lo que significa que las células convertidoras expresarán la proteína reportera tdTomato fluorescente roja. Este es un etiquetado irreversible ya que el ADN de estas células está alterado. En consecuencia, cualquier diferenciación neuronal posterior se visualizará porque la etiqueta tdTomato permanece en las células diferenciadoras. Si Ascl1 que expresa RPC derivados de MG (con etiqueta tdTomato) se diferencian en neuronas, estas neuronas aún tendrán su etiqueta roja. Este ratón, por lo tanto, permite no solo el etiquetado de RPC derivados de MG para imágenes de células vivas, sino que también permite el mapeo del destino y el rastreo de linaje de estos RPC derivados de MG (rojos). Más recientemente, se identificó el conjunto de miRNAs en RPC y se utilizaron cultivos MG de ratones Ascl1^CreERT:tdTomato^STOPfl/fl RPC-reporter para detectar y probar el efecto de estos miRNAs sobre la capacidad de reprogramación y la eficiencia²⁷. Un candidato, el RPC-miRNA miR-25, se encontró capaz de reprogramar la MG cultivada en células que expresan Ascl1 (Ascl1-Tomate+). Estas células reprogramadas adoptan características neuronales a lo largo del tiempo, incluida la morfología neuronal (somatas pequeños y procesos finos cortos o largos), la expresión de transcripciones neuronales medidas a través de scRNA-Seq, así como la expresión de proteínas neuronales validadas mediante el etiquetado inmunofluorescente²⁷.

Aquí, el protocolo detalla cómo cultivar y transfectar MG a partir de ratones P12 adaptados del trabajo anterior 21,24,27. Elegido para este protocolo es el mencionado miRNA miR-25, un miRNA altamente expresado en RPCs, con bajos niveles de expresión en MG o neuronas retinianas. Para sobreexpresar miR-25, se utilizan imitaciones murinas de miR-25, es decir, moléculas artificiales de miRNA. Como control, se eligen imitaciones de un miRNA de Caenorhabditis elegans, que no tienen función en células de mamíferos. La visualización de la conversión de MG en RPC se realizó a través del ratón reportero RPC (Ascl1^CreERT:tdTomato^STOPfl/fl), un ratón con fondo mixto (cepas C57BL/6, S129 e ICR). Sin embargo, este cultivo se puede realizar con todas las cepas de ratón, incluidas las cepas de tipo salvaje. En los últimos años, el protocolo original se ha modificado para reducir la duración de la fase de crecimiento y el período de cultivo general y garantizar un estado de células de la glía más robusto y minimizar el grado de degeneración celular, que ocurre en períodos de cultivo prolongados. La ventana de tiempo de transfección regular también se amplió de 3 h a 2 días. Como se mencionó anteriormente, aunque el protocolo actual describe los cultivos de MG como una herramienta para estudios de regeneración, el método no solo es útil para probar factores de reprogramación, sino que también se puede adaptar para otras aplicaciones, incluidos estudios sobre el comportamiento migratorio o proliferativo de MG, paradigmas relacionados con lesiones / daño celular y / o la identificación de mecanismos y vías subyacentes.