Colture cellulari primarie per studiare il potenziale di rigenerazione di Murine Müller Glia dopo il trattamento con microRNA

La glia di Müller (MG) è la glia predominante nella retina neurale. Hanno funzioni simili rispetto ad altre glia in altre parti del sistema nervoso centrale come il mantenimento dell’omeostasi dell’acqua e degli ioni, il nutrimento dei neuroni e la protezione del tessuto. Le MG hanno un’altra caratteristica affascinante: sebbene siano glia mature, esprimono ancora molti geni espressi nelle cellule progenitrici retiniche (RPC) durante lo sviluppo tardivo ^1,2. Si presume che questa somiglianza sia la ragione della rigenerazione neuronale naturale basata su MG nella retina del pesce dopo il danno retinico ^3,4. Durante questo processo, mg rientra nel ciclo cellulare e si de-differenzia in RPC che poi si differenziano in tutti e sei i tipi di neuroni retinici. Sebbene questo fenomeno si verifichi naturalmente nei pesci, i mammiferi MG non si convertono in neuroni ^5,6. Possono, tuttavia, essere riprogrammati. Una varietà di fattori hanno dimostrato di riprogrammare MG in RPC / neuroni; tra questi fattori c’è il fattore di trascrizione di base helix-loop-helix (bHLH) achaete-scute homolog 1 (Ascl1) che è coinvolto nella rigenerazione dei pesci ^7,8. Nei topi, Ascl1 è espresso solo in RPC durante la retinogenesi, ma è assente nei neuroni MG maturi o retinici⁹.

La riprogrammazione delle cellule direttamente in vivo non è solo metodologicamente impegnativa, ma richiede anche l’approvazione di un comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali. Per ricevere l’approvazione, sono necessari dati preliminari sui fattori utilizzati o alterati, sulle concentrazioni, sugli effetti fuori bersaglio, sui meccanismi sottostanti, sulla tossicità e sull’efficienza. I sistemi di coltura cellulare consentono di testare questi criteri prima dell’uso in modelli in vivo. Inoltre, poiché le MG comprendono solo circa il 5% dell’intera popolazione di cellule retiniche¹⁰, le colture di MG consentono lo studio della loro funzione¹¹ e del loro comportamento, compresa la migrazione^12,13, la proliferazione¹⁴, la reazione allo stress a lesioni/danni ^15,16, la loro interazione con altri tipi di cellule come la microglia¹⁷ o le cellule gangliari retiniche (RGC)¹⁸, o il loro potenziale neurogeno 19,20,21. Molti ricercatori utilizzano linee cellulari immortalizzate per i loro studi poiché hanno un potenziale proliferativo illimitato e possono essere facilmente mantenute e trasfettate. Le cellule primarie, tuttavia, sono preferibili per saggi biologicamente rilevanti rispetto alle cellule immortalizzate poiché hanno caratteristiche cellulari reali (espressione genica e proteica) e, cosa più importante, rappresentano un certo stadio di sviluppo e quindi hanno una “età”. L’età di un animale (e di conseguenza delle cellule ottenute da un animale) è un fattore particolarmente cruciale nella riprogrammazione cellulare poiché la plasticità cellulare si riduce con lo stadio di sviluppo progredito²².

Questo protocollo descrive in dettaglio come riprogrammare MG primario con miRNA come metodo attuale in vitro per lo studio della rigenerazione. Questo modello di coltura primaria mg è stato stabilito nel 2012 per valutare le caratteristiche di proliferazione cellulare di MG in topi knock-out P53 (topi trp53-/-)²³. È stato dimostrato che le MG coltivate mantengono le loro caratteristiche gliali (cioè l’espressione delle proteine S100β, Pax6 e Sox2 valutate tramite etichettatura immunofluorescente) e che assomigliano a MG in vivo (microarray di MG purificato con FACS)²³. Poco dopo, l’mRNA gliale e l’espressione proteica sono stati convalidati e confermati in un approccio diverso utilizzando vettori virali²⁰. Alcuni anni dopo, è stato confermato che la stragrande maggioranza delle cellule trovate in queste colture sono MG utilizzando il topo reporter Rlbp1^CreERT:tdTomato^{STOPfl/fl 24} specifico per MG. Inoltre, la quantificazione dell’insieme dei miRNA sia nella MG purificata dalla FACS che nella MG primaria in coltura ha mostrato che i livelli di MG miRNA (mGLiomiRs) non variano molto nella MG coltivata durante la fase di crescita. I periodi di coltura allungati, tuttavia, causano cambiamenti nei livelli di miRNA e di conseguenza nei livelli di mRNA e nell’espressione proteica poiché i miRNA sono regolatori traslazionali²⁵.

Nel 2013, questo modello di coltura MG è stato utilizzato per testare una varietà di fattori di trascrizione rispetto alla loro capacità di riprogrammare MG in neuroni retinici²⁰. Ascl1 è risultato essere un fattore di riprogrammazione molto robusto e affidabile. La sovraespressione di Ascl1 tramite vettori virali ha indotto cambiamenti morfologici, espressione di marcatori neuronali e acquisizione di proprietà elettrofisiologiche neuronali. Ancora più importante, le intuizioni e i risultati ottenuti da questi primi esperimenti in vitro sono stati trasferiti con successo alle applicazioni in vivo ^22,26 dimostrando che le ^colture primarie di MG rappresentano uno strumento solido e affidabile per gli screening fattoriali iniziali e la valutazione delle caratteristiche gliali prima dell’implementazione in vivo.

Alcuni anni fa, è stato dimostrato che il miRNA miR-124 arricchito dal cervello, che è anche altamente espresso nei neuroni della retina, può indurre l’espressione di Ascl1 in^{MG 21 coltivato}. L’espressione di Ascl1 nelle cellule viventi è stata visualizzata tramite un topo reporter Ascl1 (Ascl1^CreERT:tdTomato^STOPfl/fl). Un topo reporter è un topo geneticamente modificato che ha un gene reporter inserito nel suo DNA. Questo gene reporter codifica per una proteina reporter, che è in questo studio tdTomato, una proteina fluorescente rossa. Questa proteina reporter riporta l’espressione di un gene di interesse, in questo caso, Ascl1. In altre parole, le celle che esprimono Ascl1 diventeranno rosse. Poiché Ascl1 è espresso solo in RPC⁹, questo mouse Ascl1^CreERT:tdTomato^STOPfl/fl consente il monitoraggio della conversione MG in RPC che esprimono Ascl1 , il che significa che le cellule in conversione esprimeranno la proteina reporter tdTomato fluorescente rossa. Questa è un’etichettatura irreversibile poiché il DNA di queste cellule è alterato. Di conseguenza, qualsiasi successiva differenziazione neuronale verrà visualizzata perché l’etichetta tdTomato rimane nelle cellule differenzianti. Se Ascl1 che esprime RPC derivate da MG (con etichetta tdTomato) si differenzia in neuroni, questi neuroni avranno ancora la loro etichetta rossa. Questo topo, quindi, consente non solo l’etichettatura di RPC derivati da MG per l’imaging di cellule vive, ma consente anche la mappatura del destino e il tracciamento del lignaggio di questi RPC (rossi) derivati da MG. Più recentemente, è stato identificato il set di miRNA nelle RPC e sono state utilizzate colture MG di topi ascl1^CreERT:tdTomato^STOPfl/fl RPC-reporter per lo screening e il test dell’effetto di questi miRNA sulla capacità di riprogrammazione e sull’efficienza²⁷. Un candidato, l’RPC-miRNA miR-25, è stato trovato in grado di riprogrammare MG coltivato in cellule che esprimono Ascl1 (Ascl1-Tomato +). Queste cellule riprogrammate adottano caratteristiche neuronali nel tempo, tra cui la morfologia neuronale (piccoli somata e processi fini brevi o lunghi), l’espressione di trascritti neuronali misurati tramite scRNA-Seq, nonché l’espressione di proteine neuronali convalidate tramite l’etichettatura immunofluorescente²⁷.

Qui, il protocollo descrive in dettaglio come coltivare e trasfettare MG da topi P12 adattati dal lavoro precedente 21,24,27. Scelto per questo protocollo è il già citato miRNA miR-25, un miRNA altamente espresso in RPC, con bassi livelli di espressione in MG o neuroni retinici. Per sovraesprimere miR-25, mi mimica miR-25 murina, cioè vengono utilizzate molecole di miRNA artificiali. Come controllo, vengono scelte imitazioni di un miRNA da Caenorhabditis elegans, che non hanno alcuna funzione nelle cellule di mammifero. La visualizzazione della conversione di MG in RPC è stata effettuata tramite il mouse reporter RPC (Ascl1^CreERT:tdTomato^STOPfl/fl), un mouse con sfondo misto (ceppi C57BL/6, S129 e ICR). Questa coltura può, tuttavia, essere eseguita con tutti i ceppi di topo, compresi i ceppi wild-type. Negli ultimi anni, il protocollo originale è stato modificato per ridurre la durata della fase di crescita e il periodo di coltura complessivo e garantire uno stato delle cellule glialiche più robusto e ridurre al minimo il grado di degenerazione cellulare, che si verifica in periodi di coltura prolungati. Anche la finestra temporale di trasfezione regolare è stata estesa da 3 ore a 2 giorni. Come accennato in precedenza, sebbene l’attuale protocollo descriva le colture MG come strumento per gli studi di rigenerazione, il metodo non è solo utile per testare i fattori di riprogrammazione, ma può anche essere adattato per altre applicazioni, inclusi studi sul comportamento migratorio o proliferativo della MG, paradigmi correlati a lesioni / danni cellulari e / o l’identificazione di meccanismi e percorsi sottostanti.