Cultures cellulaires primaires pour étudier le potentiel de régénération de murin Müller Glia après un traitement par microARN

La glie de Müller (MG) est la glie prédominante dans la rétine neurale. Ils ont des fonctions similaires à celles d’autres glies dans d’autres parties du système nerveux central, telles que le maintien de l’homéostasie de l’eau et des ions, la nutrition des neurones et la protection des tissus. Les MG ont une autre caractéristique fascinante : bien qu’ils soient des glie matures, ils expriment encore de nombreux gènes exprimés dans les cellules progénitrices rétiniennes (RPC) à la fin du développement ^1,2. Cette ressemblance est supposée être la raison de la régénération neuronale naturelle à base de MG dans la rétine du poisson après une lésion rétinienne ^3,4. Au cours de ce processus, MG rentre dans le cycle cellulaire et se différencie en RPC qui se différencient ensuite en six types de neurones rétiniens. Bien que ce phénomène se produise naturellement chez les poissons, les MG de mammifères ne se convertissent pas en neurones ^5,6. Ils peuvent toutefois être reprogrammés. Il a été démontré qu’une variété de facteurs reprogramment mg en RPC / neurones; parmi ces facteurs figure le facteur de transcription de base hélice-boucle-hélice (bHLH) homologue achaete-scute 1 (Ascl1) qui est impliqué dans la régénération des poissons ^7,8. Chez la souris, Ascl1 n’est exprimé que dans les RPC pendant la rétinogenèse mais est absent dans les neurones MG matures ou rétiniens⁹.

La reprogrammation des cellules directement in vivo est non seulement difficile sur le plan méthodologique, mais nécessite également l’approbation d’un comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux. Pour recevoir l’approbation, des données préliminaires sur le ou les facteurs utilisés ou modifiés, les concentrations, les effets hors cible, les mécanismes sous-jacents, la toxicité et l’efficacité sont requises. Les systèmes de culture cellulaire permettent de tester ces critères avant utilisation dans des modèles in vivo. De plus, comme les MG ne représentent qu’environ 5% de l’ensemble de la population de cellules rétiniennes¹⁰, les cultures MG permettent d’étudier leur fonction¹¹ ainsi que leur comportement, y compris la migration ^12,13, la prolifération¹⁴, la réaction au stress aux blessures / dommages^15,16, leur interaction avec d’autres types de cellules telles que la microglie¹⁷ ou les cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR)¹⁸, ou leur potentiel neurogène 19,20,21. De nombreux chercheurs utilisent des lignées cellulaires immortalisées pour leurs études car elles ont un potentiel prolifératif illimité et peuvent être facilement maintenues et transfectées. Les cellules primaires, cependant, sont préférables pour les essais biologiquement pertinents que les cellules immortalisées car elles ont de vraies caractéristiques cellulaires (expression des gènes et des protéines) et, plus important encore, elles représentent un certain stade de développement et ont donc un « âge ». L’âge d’un animal (et par conséquent des cellules obtenues à partir d’un animal) est un facteur particulièrement crucial dans la reprogrammation cellulaire puisque la plasticité cellulaire diminue avec le stade de développement avancé²².

Ce protocole décrit en détail comment reprogrammer la MG primaire avec des miARN comme méthode in vitro actuelle pour étudier la régénération. Ce modèle de culture primaire MG a été établi en 2012 pour évaluer les caractéristiques de prolifération cellulaire de MG chez les souris knock-out P53 (souris trp53-/-)²³. Il a été démontré que les MG cultivés conservent leurs caractéristiques gliales (c’est-à-dire l’expression des protéines S100β, Pax6 et Sox2 évaluées par marquage immunofluorescent), et qu’ils ressemblent à des MG in vivo (microréseau de MG purifié par FACS)²³. Peu de temps après, l’expression de l’ARNm glial et des protéines a été validée et confirmée dans une approche différente utilisant des vecteurs viraux²⁰. Quelques années plus tard, il a été confirmé que la grande majorité des cellules trouvées dans ces cultures sont MG en utilisant la souris rapporteur Rlbp1^CreERT:tdTomato^{STOPfl/fl spécifique à MG 24}. De plus, la quantification de l’ensemble des miARN dans le MG purifié par FACS et le MG primaire cultivé a montré que les niveaux de mg miARN (mGLiomiRs) ne varient pas beaucoup dans le MG cultivé pendant la phase de croissance. Les périodes de culture allongées, cependant, provoquent des changements dans les niveaux de miARN et, par conséquent, dans les niveaux d’ARNm et l’expression des protéines, car les miARN sont des régulateurs translationnels²⁵.

En 2013, ce modèle de culture MG a été utilisé pour tester une variété de facteurs de transcription en ce qui concerne leur capacité à reprogrammer MG dans les neurones rétiniens²⁰. Ascl1 s’est avéré être un facteur de reprogrammation très robuste et fiable. La surexpression d’Ascl1 via des vecteurs viraux a induit des changements morphologiques, l’expression de marqueurs neuronaux et l’acquisition de propriétés électrophysiologiques neuronales. Plus important encore, les connaissances et les résultats obtenus à partir de ces premières expériences in vitro ont été transférés avec succès à des applications in vivo ^22,26, démontrant que les cultures MG primaires représentent un outil solide et fiable pour les criblages factoriels initiaux et l’évaluation des caractéristiques gliales avant la mise en œuvre in vivo.

Il y a quelques années, il a été démontré que le miARN miR-124 enrichi par le cerveau, qui est également fortement exprimé dans les neurones rétiniens, peut induire l’expression d’Ascl1 dans MG²¹ cultivé. L’expression d’Ascl1 dans les cellules vivantes a été visualisée via une souris rapporteure Ascl1 (Ascl1^CreERT:tdTomato^STOPfl/fl). Une souris rapporteure est une souris génétiquement modifiée qui a un gène rapporteur inséré dans son ADN. Ce gène rapporteur code pour une protéine rapporteure, qui est dans cette étude tdTomato, une protéine fluorescente rouge. Cette protéine rapporteure rapporte l’expression d’un gène d’intérêt, en l’occurrence Ascl1. En d’autres termes, les cellules qui expriment Ascl1 deviendront rouges. Étant donné qu’Ascl1 n’est exprimé que dans les RPC⁹, cette souris Ascl1^CreERT:tdTomato^STOPfl/fl permet de suivre la conversion DE MG en RPC exprimant Ascl1 , ce qui signifie que la conversion des cellules exprimera la protéine rapporteure tdTomato fluorescente rouge. Il s’agit d’un marquage irréversible puisque l’ADN de ces cellules est altéré. Par conséquent, toute différenciation neuronale ultérieure sera visualisée car l’étiquette tdTomato reste dans les cellules différenciantes. Si Ascl1 exprimant des RPC dérivés de MG (avec étiquette tdTomato) se différencient en neurones, ces neurones auront toujours leur étiquette rouge. Cette souris permet donc non seulement l’étiquetage des RPC dérivés de MG pour l’imagerie de cellules vivantes, mais permet également la cartographie du destin et le traçage de la lignée de ces RPC dérivés de MG (rouges). Plus récemment, l’ensemble des miARN dans les RPC a été identifié et des cultures MG de souris Ascl1^CreERT:tdTomato^STOPfl/fl RPC-reporter ont été utilisées pour dépister et tester l’effet de ces miARN sur la capacité et l’efficacité de reprogrammation²⁷. Un candidat, le RPC-miRNA miR-25, s’est avéré capable de reprogrammer la MG cultivée dans des cellules exprimant Ascl1 (Ascl1-Tomato+). Ces cellules reprogrammées adoptent des caractéristiques neuronales au fil du temps, y compris la morphologie neuronale (petits somata et processus fins courts ou longs), l’expression des transcriptions neuronales mesurées via scRNA-Seq, ainsi que l’expression de protéines neuronales validées par marquage immunofluorescent²⁷.

Ici, le protocole détaille comment cultiver et transfecter MG à partir de souris P12 adaptées des travaux^précédents 21,24,27. Choisi pour ce protocole est le miARN miR-25 susmentionné, un miARN fortement exprimé dans les RPC, avec de faibles niveaux d’expression dans les neurones MG ou rétiniens. Afin de surexprimer miR-25, des mimiques murines miR-25, c’est-à-dire des molécules artificielles de miARN sont utilisées. Comme contrôle, on choisit des imitations d’un miARN de Caenorhabditis elegans, qui n’ont aucune fonction dans les cellules de mammifères. La visualisation de la conversion de MG en RPC a été réalisée via la souris rapporteur RPC (Ascl1^CreERT:tdTomato^STOPfl/fl), une souris avec un fond mixte (souches C57BL/6, S129 et ICR). Cette culture peut toutefois être réalisée avec toutes les souches de souris, y compris les souches de type sauvage. Au cours des dernières années, le protocole original a été modifié pour réduire la durée de la phase de croissance et la période de culture globale et assurer un statut de cellule gliale plus robuste et minimiser le degré de dégénérescence cellulaire, qui se produit pendant les périodes de culture prolongées. La fenêtre de temps de transfection régulière a également été prolongée de 3 h à 2 jours. Comme mentionné précédemment, bien que le protocole actuel décrive les cultures MG comme un outil pour les études de régénération, la méthode est non seulement utile pour tester les facteurs de reprogrammation, mais peut également être adaptée à d’autres applications, y compris des études sur le comportement migratoire ou prolifératif MG, les paradigmes liés aux blessures / dommages cellulaires, et / ou l’identification des mécanismes et des voies sous-jacents.