マイクロRNA処理後のマウスミュラーグリアの再生可能性を研究するための初代細胞培養

ミュラーグリア(MG)は、神経網膜における優勢なグリアである。それらは、水とイオンの恒常性の維持、ニューロンの栄養補給、組織の保護など、中枢神経系の他の部分の他のグリアと比較して同様の機能を有する。MGにはもう一つの魅力的な特徴があります:成熟したグリアですが、発達後期に網膜前駆細胞(RPC)で発現する多くの遺伝子を発現しています^1,2。この類似性は、網膜損傷後の魚網膜における天然に存在するMGベースのニューロン再生の理由であると仮定される^3,4。このプロセスの間、MGは細胞周期に再突入し、RPCに脱分化し、その後、6種類の網膜ニューロンすべてに分化する。この現象は魚類では自然に起こるが、哺乳類のMGは^{ニューロン5,6}に変換されない。ただし、再プログラムすることはできます。MGをRPC/ニューロンに再プログラムする様々な要因が示されている。これらの因子の中には、魚の再生に関与する基本的なヘリックス・ループ・ヘリックス(bHLH)転写因子アカイテ・スキュートホモログ1(Ascl1)がある^7,8。マウスでは、Ascl1は網膜形成中にRPCでのみ発現するが、成熟MGまたは網膜ニューロン⁹には存在しない。

インビボで細胞を直接リプログラミングすることは、方法論的に難しいだけでなく、施設の動物ケアおよび使用委員会からの承認も必要とします。承認を受けるには、使用または変更された因子、濃度、オフターゲット効果、根底にあるメカニズム、毒性、および効率に関する予備データが必要です。細胞培養システムは、in vivoモデルでの使用前にこれらの基準を試験することを可能にする。さらに、MGは網膜細胞集団10全体の約5%しか占めていないので、MG培養物は、遊走12、¹³、増殖14、傷害/損傷に対するストレス反応^15、16、ミクログリア17または網膜神経節細胞(RGC)などの他の細胞型との相互作用を含む、それらの機能¹¹ならびにそれらの挙動の研究を可能にする¹⁸、 またはそれらの神経原性潜在能力¹⁹、^20、21。多くの研究者は、無限の増殖性を有し、容易に維持およびトランスフェクトすることができるため、不死化細胞株を研究に使用している。しかし、初代細胞は、真の細胞特性(遺伝子およびタンパク質の発現)を有し、さらに重要なことに、それらは発達の特定の段階を表し、したがって「年齢」を有するため、不死化細胞よりも生物学的に関連するアッセイに好ましい。動物の年齢(そしてその結果として動物から得られた細胞の年齢)は、細胞の可塑性が発達段階の進行とともに減少するため、細胞のリプログラミングにおいて特に重要な要素である²²。

このプロトコルは、再生を研究するための現在の in vitro 法として、miRNAで原発性MGを再プログラムする方法を詳細に説明しています。このMG初代培養モデルは、P53ノックアウトマウス(trp53-/-マウス)におけるMGの細胞増殖特性を評価するために^{2012年に設立されました23}。培養MGはグリアの特徴(すなわち、免疫蛍光標識 を介して 評価されたS100β、Pax6、およびSox2タンパク質の発現)を維持し、 in vivo MG(FACS精製MGのマイクロアレイ)に類似していることが示された²³。その後まもなく、グリアmRNAおよびタンパク質発現が検証され、ウイルス^{ベクター20}を用いた別のアプローチで確認された。数年後、MG特異的 Rlbp1^CreERT:tdTomato^STOPfl/fl レポーターマウス²⁴を用いて、これらの培養物に見られる細胞の大部分がMGであることを確認した。さらに、FACS精製MGおよび培養初代MGの両方におけるmiRNAのセットの定量は、MG miRNA(mGLiomiRs)のレベルが増殖期中の培養MGにおいてあまり変化しないことを示した。しかし、培養期間が細長いと、miRNAが翻訳調節因子であるため、miRNAレベル、ひいてはmRNAレベルおよびタンパク質発現の変化を引き起こす²⁵。

2013年、このMG培養モデルを用いて、MGを網膜ニューロンに再プログラムする能力に関して様々な転写因子を試験した²⁰。Ascl1は非常に堅牢で信頼性の高いリプログラミング因子であることが判明しました。ウイルスベクターを介したAscl1の過剰発現は、形態学的変化、ニューロンマーカーの発現、およびニューロン電気生理学的特性の獲得を誘導した。さらに重要なことに、これらの最初のインビトロ実験から得られた洞察と結果は、インビボアプリケーション^22,26に首尾よく転送され^、初代MG培養物がインビボ実装前の初期因子スクリーニングおよびグリア特徴の評価のための固体で信頼性の高いツールを表すことを実証した。

数年前、網膜ニューロンでも高発現している脳富化miRNA miR-124が、培養MG²¹でAscl1発現を誘導できることが示されました。生細胞におけるAscl1発現を、Ascl1レポーターマウス(Ascl1^CreERT:tdTomato^STOPfl/fl)を介して可視化した。レポーターマウスは、DNAにレポーター遺伝子が挿入された遺伝子操作マウスです。このレポーター遺伝子は、本研究における赤色蛍光タンパク質であるtdTomatoであるレポータータンパク質をコードする。このレポータータンパク質は、目的の遺伝子(この場合はAscl1)の発現を報告する。つまり、Ascl1 を発現する細胞は赤色に変わります。Ascl1はRPCs9でのみ発現するため、このAscl1^CreERT:tdTomato^STOPfl/flマウスは、RPCを発現するAscl1へのMG変換の追跡を可能にし、変換細胞が赤色蛍光tdTomatoレポータータンパク質を発現することを意味する。これらの細胞のDNAが改変されるため、これは不可逆的な標識である。その結果、tdTomato標識が分化細胞に残るため、その後の神経分化は視覚化されます。MG由来RPC(tdTomato標識を有する)を発現するAscl1がニューロンに分化したとしても、これらのニューロンは依然として赤色のラベルを有する。したがって、このマウスは、生細胞イメージングのためのMG由来RPCの標識を可能にするだけでなく、これらのMG由来(赤色)RPCの運命マッピングおよび系統追跡も可能にする。より最近では、RPC中のmiRNAのセットが同定され、Ascl1^CreERT:tdTomato^STOPfl/fl RPCレポーターマウスのMG培養物を用いて、これらのmiRNAがリプログラミング能力および効率に及ぼす影響をスクリーニングおよび試験した²⁷。候補の1つであるRPC-miRNA miR-25は、培養したMGをAscl1発現細胞(Ascl1-Tomato+)にリプログラミングできることを見出した。これらの再プログラムされた細胞は、ニューロンの形態(小さなソマタおよび短いまたは長い微細プロセスのいずれか)、scRNA-Seqを介して測定されたニューロン転写産物の発現、ならびに免疫蛍光標識を介して検証されたニューロンタンパク質の発現を含む、経時的なニューロンの特徴を採用する²⁷。

ここで、プロトコルは、以前の研究21、²⁴、²⁷から適応したP12マウスからMGを増殖およびトランスフェクトする方法を詳述する。このプロトコールのために選択されたのは、前述のmiRNA miR-25であり、RPCにおいて高発現し、MGまたは網膜ニューロンにおいて低い発現レベルを有するmiRNAである。miR−25を過剰発現させるために、マウスmiR−25模倣体、すなわち、人工miRNA分子が使用される。対照として、Caenorhabditis elegansからのmiRNAの模倣物が選択され、哺乳動物細胞では機能を持たない。MGのRPCへの変換の可視化は、RPCレポーターマウス(Ascl1^CreERT:tdTomato^STOPfl/fl)、バックグラウンドが混在するマウス(C57BL/6、S129、およびICR株)を介して達成された。しかしながら、この培養は、野生型株を含むすべてのマウス株を用いて行うことができる。過去数年間で、元のプロトコルは、成長期の持続時間と全体的な培養期間を短縮し、より堅牢なグリア細胞の状態を確保し、長期の培養期間に起こる細胞変性の程度を最小限に抑えるように変更されました。通常のトランスフェクション時間枠も3時間から2日に延長されました。前述のように、現在のプロトコルはMG培養物を再生研究のためのツールとして記述しているが、この方法は初期化因子の試験に有用であるだけでなく、MG遊走性または増殖性挙動、傷害/細胞損傷関連のパラダイム、および/または根底にあるメカニズムおよび経路の同定に関する研究を含む他の用途にも適応させることができる。