Primaire celculturen om het regeneratiepotentieel van Murine Müller Glia na microRNA-behandeling te bestuderen

De Müller glia (MG) zijn de overheersende glia in het neurale netvlies. Ze hebben vergelijkbare functies in vergelijking met andere glia in andere delen van het centrale zenuwstelsel, zoals het handhaven van de water- en ionhomeostase, het voeden van neuronen en het beschermen van het weefsel. MG hebben nog een fascinerend kenmerk: hoewel ze volwassen glia zijn, brengen ze nog steeds veel genen tot expressie die tot expressie komen in retinale voorlopercellen (RPC’s) tijdens de late ontwikkeling ^1,2. Deze gelijkenis wordt verondersteld de reden te zijn voor de natuurlijk voorkomende op MG gebaseerde neuronale regeneratie in het netvlies van vissen na retinale schade ^3,4. Tijdens dit proces komt MG opnieuw in de celcyclus en de-differentieert in RPC’s die vervolgens differentiëren in alle zes soorten retinale neuronen. Hoewel dit fenomeen van nature voorkomt bij vissen, zet mg van zoogdieren niet om in neuronen ^5,6. Ze kunnen echter worden geherprogrammeerd. Van een verscheidenheid aan factoren is aangetoond dat ze MG herprogrammeren in RPC’s / neuronen; een van deze factoren is de basis helix-loop-helix (bHLH) transcriptiefactor achaete-scute homoloog 1 (Ascl1) die betrokken is bij visregeneratie ^7,8. Bij muizen komt Ascl1 alleen tot expressie in RPC’s tijdens retinogenese, maar is afwezig in volwassen MG- of retinale neuronen⁹.

Het direct in vivo herprogrammeren van cellen is niet alleen methodologisch uitdagend, maar vereist ook goedkeuring van een instellingscommissie voor dierverzorging en -gebruik. Om goedkeuring te krijgen, zijn voorlopige gegevens nodig over de gebruikte of gewijzigde factor(en), concentraties, off-target effecten, onderliggende mechanismen, toxiciteit en efficiëntie. Celkweeksystemen maken het mogelijk om deze criteria te testen voordat ze in in vivo modellen worden gebruikt. Bovendien, aangezien MG slechts ongeveer 5% van de gehele retinale celpopulatie¹⁰ omvat, maken MG-culturen de studie van hun functie¹¹ en hun gedrag mogelijk, inclusief migratie^12,13, proliferatie¹⁴, stressreactie op letsel / schade^15,16, hun interactie met andere celtypen zoals microglia¹⁷ of retinale ganglioncellen (RGC’s)¹⁸, of hun neurogene potentieel 19,20,21. Veel onderzoekers gebruiken onsterfelijke cellijnen voor hun studies, omdat ze een onbeperkt proliferatief potentieel hebben en gemakkelijk kunnen worden onderhouden en getransfecteerd. Primaire cellen hebben echter de voorkeur voor biologisch relevante testen dan vereeuwigde cellen, omdat ze echte celkenmerken hebben (gen- en eiwitexpressie) en, nog belangrijker, ze vertegenwoordigen een bepaald stadium in ontwikkeling en hebben daarom een “leeftijd”. De leeftijd van een dier (en bijgevolg van de cellen verkregen van een dier) is een bijzonder cruciale factor bij cellulaire herprogrammering, omdat de plasticiteit van cellen afneemt met het gevorderde stadium van ontwikkeling²².

Dit protocol beschrijft in detail hoe primaire MG met miRNA’s kan worden geherprogrammeerd als een huidige in vitro methode voor het bestuderen van regeneratie. Dit MG primaire kweekmodel werd in 2012 opgericht om celproliferatiekenmerken van MG te evalueren bij P53 knock-out muizen (trp53-/- muizen)²³. Er werd aangetoond dat gekweekte MG hun gliale kenmerken behouden (d.w.z. expressie van S100β-, Pax6- en Sox2-eiwitten geëvalueerd via immunofluorescente etikettering), en dat ze lijken op in vivo MG (microarray van FACS-gezuiverde MG)²³. Kort daarna werden gliale mRNA en eiwitexpressie gevalideerd en bevestigd in een andere benadering met behulp van virale vectoren²⁰. Een paar jaar later werd bevestigd dat de overgrote meerderheid van de cellen in deze culturen MG zijn met behulp van de MG-specifieke Rlbp1^CreERT: tdTomato^{STOPfl / fl} reporter mouse²⁴. Bovendien toonde kwantificering van de set miRNA’s in zowel FACS-gezuiverde MG als gekweekte primaire MG aan dat de niveaus van MG miRNA’s (mGLiomiRs) niet veel variëren in gekweekte MG tijdens de groeifase. Langgerekte kweekperioden veroorzaken echter veranderingen in miRNA-niveaus en bijgevolg in mRNA-niveaus en eiwitexpressie, aangezien miRNA’s translationele regulatoren zijn²⁵.

In 2013 werd dit MG-cultuurmodel gebruikt om een verscheidenheid aan transcriptiefactoren te testen met betrekking tot hun vermogen om MG te herprogrammeren in retinale neuronen²⁰. Ascl1 bleek een zeer robuuste en betrouwbare herprogrammeringsfactor te zijn. Overexpressie van Ascl1 via virale vectoren veroorzaakte morfologische veranderingen, expressie van neuronale markers en de verwerving van neuronale elektrofysiologische eigenschappen. Wat nog belangrijker is, de inzichten en resultaten verkregen uit deze eerste in vitro experimenten werden met succes overgebracht naar in vivo toepassingen^{22,26 wat} aantoont dat primaire MG-culturen een solide en betrouwbaar hulpmiddel vormen voor initiële factorscreenings en evaluatie van gliale kenmerken voorafgaand aan in vivo implementatie.

Een paar jaar geleden werd aangetoond dat het met de hersenen verrijkte miRNA miR-124, dat ook sterk tot expressie komt in retinale neuronen, Ascl1-expressie kan induceren in gekweekte MG²¹. Ascl1-expressie in levende cellen werd gevisualiseerd via een Ascl1 reportermuis (Ascl1^CreERT:tdTomato^STOPfl/fl). Een reportermuis is een genetisch gemanipuleerde muis waarvan een reporter-gen in zijn DNA is ingebracht. Dit reporter-gen codeert voor een reporter-eiwit, dat in deze studie tdTomato is, een rood fluorescerend eiwit. Dit reporter-eiwit rapporteert de expressie van een gen van belang, in dit geval Ascl1. Met andere woorden, cellen die Ascl1 tot expressie brengen, worden rood. Aangezien Ascl1 alleen tot expressie komt in RPC’s⁹, maakt deze Ascl1^CreERT:tdTomato^STOPfl/fl muis het mogelijk om mg-conversie te volgen in Ascl1-expresserende RPC’s, wat betekent dat converterende cellen rode fluorescerende tdTomato-reportereiwitten tot expressie zullen brengen. Dit is onomkeerbare etikettering omdat het DNA van deze cellen is veranderd. Bijgevolg zal elke daaropvolgende neuronale differentiatie worden gevisualiseerd omdat het tdTomato-label in differentiërende cellen blijft. Als Ascl1-expressie mg-afgeleide RPC’s (met tdTomato-label) differentiëren in neuronen, zullen deze neuronen nog steeds hun rode label hebben. Deze muis maakt daarom niet alleen de etikettering van MG-afgeleide RPC’s mogelijk voor live-cell imaging, maar maakt ook fate mapping en lineage tracing van deze MG-afgeleide (rode) RPC’s mogelijk. Meer recent werd de set miRNA’s in RPC’s geïdentificeerd en werden MG-culturen van Ascl1^CreERT: tdTomato^{STOPfl / fl} RPC-reporter-muizen gebruikt om het effect van deze miRNA’s op herprogrammeringscapaciteit en efficiëntie te screenen en te testen²⁷. Eén kandidaat, de RPC-miRNA miR-25, bleek in staat om gekweekte MG te herprogrammeren in Ascl1-expressie (Ascl1-Tomato+) cellen. Deze geherprogrammeerde cellen nemen in de loop van de tijd neuronale kenmerken aan, waaronder neuronale morfologie (kleine somata en korte of lange fijne processen), expressie van neuronale transcripten gemeten via scRNA-Seq, evenals expressie van neuronale eiwitten gevalideerd via immunofluorescente etikettering²⁷.

Hier beschrijft het protocol hoe MG te kweken en te transfecteren van P12-muizen aangepast van het vorige werk 21,24,27. Gekozen voor dit protocol is het eerder genoemde miRNA miR-25, een miRNA dat sterk tot expressie komt in RPC’s, met lage expressieniveaus in MG of retinale neuronen. Om miR-25 te overexpressie te geven, worden murine miR-25-mimiek, d.w.z. kunstmatige miRNA-moleculen gebruikt. Als controle worden mimics van een miRNA van Caenorhabditis elegans gekozen, die geen functie hebben in zoogdiercellen. Visualisatie van de omzetting van MG in RPC’s werd bereikt via de RPC reporter muis (Ascl1^CreERT:tdTomato^STOPfl/fl), een muis met gemengde achtergrond (C57BL/6, S129 en ICR stammen). Deze kweek kan echter worden uitgevoerd met alle muizenstammen, inclusief wildtype stammen. In de afgelopen jaren is het oorspronkelijke protocol aangepast om de duur van de groeifase en de algehele kweekperiode te verminderen en een robuustere gliacelstatus te garanderen en de mate van cellulaire degeneratie, die optreedt in langdurige kweekperioden, te minimaliseren. Het reguliere transfectietijdvenster werd ook verlengd van 3 uur naar 2 dagen. Zoals eerder vermeld, hoewel het huidige protocol MG-culturen beschrijft als een hulpmiddel voor regeneratiestudies, is de methode niet alleen nuttig voor het testen van herprogrammeringsfactoren, maar kan deze ook worden aangepast voor andere toepassingen, waaronder studies over MG-migratie of proliferatief gedrag, letsel / celschade gerelateerde paradigma’s en / of de identificatie van onderliggende mechanismen en paden.