Primäre Zellkulturen zur Untersuchung des Regenerationspotenzials von murinen Müller-Glia nach MicroRNA-Behandlung

Die Müllerglia (MG) sind die vorherrschenden Gliazellen in der neuronalen Netzhaut. Sie haben ähnliche Funktionen im Vergleich zu anderen Gliazellen in anderen Teilen des zentralen Nervensystems, wie z.B. die Aufrechterhaltung der Wasser- und Ionenhomöostase, die Ernährung von Neuronen und den Schutz des Gewebes. MG haben eine weitere faszinierende Eigenschaft: Obwohl sie reife Gliazellen sind, exprimieren sie immer noch viele Gene, die in retinalen Vorläuferzellen (RPCs) während der späten Entwicklung exprimiert^{werden 1,2}. Es wird angenommen, dass diese Ähnlichkeit der Grund für die natürlich vorkommende MG-basierte neuronale Regeneration in der Netzhaut der Fische nach Netzhautschäden^{ist 3,4}. Während dieses Prozesses tritt MG wieder in den Zellzyklus ein und dedifferenziert sich in RPCs, die sich dann in alle sechs Arten von Netzhautneuronen differenzieren. Obwohl dieses Phänomen natürlich bei Fischen auftritt, wandeln sich MG von Säugetieren nicht in Neuronen^{um 5,6}. Sie können jedoch umprogrammiert werden. Es wurde gezeigt, dass eine Vielzahl von Faktoren MG in RPCs / Neuronen umprogrammiert; Zu diesen Faktoren gehört der grundlegende Helix-Loop-Helix (bHLH)-Transkriptionsfaktor achaete-scute homolog 1 (Ascl1), der an der Fischregeneration beteiligt ist ^7,8. Bei Mäusen wird Ascl1 während der Retinogenese nur in RPCs exprimiert, fehlt jedoch in reifen MG- oder retinalen Neuronen⁹.

Die direkte Reprogrammierung von Zellen in vivo ist nicht nur eine methodische Herausforderung, sondern erfordert auch die Genehmigung eines institutionellen Ausschusses für Tierpflege und -nutzung. Um die Zulassung zu erhalten, sind vorläufige Daten über die verwendeten oder veränderten Faktoren, Konzentrationen, Off-Target-Effekte, zugrunde liegende Mechanismen, Toxizität und Effizienz erforderlich. Zellkultursysteme ermöglichen es, diese Kriterien vor der Verwendung in In-vivo-Modellen zu testen. Da MG nur etwa 5% der gesamten retinalen Zellpopulation^{ausmachen 10}, ermöglichen MG-Kulturen die Untersuchung ihrer Funktion 11 sowie ihres Verhaltens, einschließlich Migration 12,13, Proliferation 14, Stressreaktion auf Verletzungen/Schäden^15,16, ihrer Interaktion mit anderen Zelltypen wie Mikroglia 17 oder retinalen Ganglienzellen (RGCs)^18, oder ihr neurogenes Potential 19,20,21. Viele Forscher verwenden immortalisierte Zelllinien für ihre Studien, da sie ein unbegrenztes proliferatives Potenzial haben und leicht aufrechterhalten und transfiziert werden können. Primärzellen sind jedoch für biologisch relevante Assays besser geeignet als unsterbliche Zellen, da sie echte Zelleigenschaften (Gen- und Proteinexpression) aufweisen und, was noch wichtiger ist, ein bestimmtes Entwicklungsstadium darstellen und daher ein “Alter” haben. Das Alter eines Tieres (und folglich der von einem Tier gewonnenen Zellen) ist ein besonders entscheidender Faktor bei der zellulären Reprogrammierung, da die Zellplastizität mit fortschreitendem Entwicklungsstadium abnimmt²².

Dieses Protokoll beschreibt detailliert, wie primäres MG mit miRNAs als aktuelle In-vitro-Methode zur Untersuchung der Regeneration umprogrammiert werden kann. Dieses MG-Primärkulturmodell wurde 2012 etabliert, um die Zellproliferationseigenschaften von MG in P53-Knock-out-Mäusen (trp53-/- Mäuse⁾²³ zu bewerten. Es wurde gezeigt, dass kultivierte MG ihre Gliaeigenschaften beibehalten (d. h. Expression von S100β-, Pax6- und Sox2-Proteinen, die über Immunfluoreszenzmarkierung bewertet werden) und dass sie in vivo MG (Microarray of FACS-gereinigtem MG)²³ ähneln. Kurz darauf wurden gliale mRNA und Proteinexpression validiert und in einem anderen Ansatz mit viralen Vektoren^{bestätigt 20}. Einige Jahre später wurde bestätigt, dass die überwiegende Mehrheit der in diesen Kulturen gefundenen Zellen MG ist, indem die MG-spezifische Rlbp1^CreERT:tdTomato^STOPfl/fl Reportermaus^{24 verwendet wurde}. Darüber hinaus zeigte die Quantifizierung des Satzes von miRNAs sowohl in FACS-gereinigtem MG als auch in kultiviertem primärem MG, dass die Spiegel von MG-miRNAs (mGLiomiRs) in kultiviertem MG während der Wachstumsphase nicht sehr unterschiedlich sind. Verlängerte Kulturperioden verursachen jedoch Veränderungen der miRNA-Spiegel und folglich der mRNA-Spiegel und der Proteinexpression, da miRNAs translationale Regulatoren^{sind 25}.

Im Jahr²⁰¹³ wurde dieses MG-Kulturmodell verwendet, um eine Vielzahl von Transkriptionsfaktoren in Bezug auf ihre Fähigkeit zu testen, MG in retinale Neuronen 20 umzuprogrammieren. Ascl1 erwies sich als sehr robuster und zuverlässiger Reprogrammierungsfaktor. Die Überexpression von Ascl1 über virale Vektoren induzierte morphologische Veränderungen, die Expression neuronaler Marker und den Erwerb neuronaler elektrophysiologischer Eigenschaften. Noch wichtiger ist, dass die Erkenntnisse und Ergebnisse aus diesen ersten In-vitro-Experimenten erfolgreich auf In-vivo-Anwendungen^{übertragen wurden 22,26}, die zeigen^, dass primäre MG-Kulturen ein solides und zuverlässiges Werkzeug für anfängliche Faktor-Screenings und die Bewertung von Glia-Merkmalen vor der In-vivo-Implementierung darstellen.

Vor einigen Jahren wurde gezeigt, dass die mit dem Gehirn angereicherte miRNA miR-124, die auch in retinalen Neuronen hoch exprimiert wird, die Ascl1-Expression in kultiviertem MG²¹ induzieren kann. Die Ascl1-Expression in lebenden Zellen wurde über eine Ascl1-Reportermaus (Ascl1 ^{CreERT:tdTomato STOPfl/fl)} visualisiert. Eine Reportermaus ist eine gentechnisch veränderte Maus, in deren DNA ein Reportergen eingefügt wurde. Dieses Reporter-Gen kodiert für ein Reporterprotein, das in dieser Studie tdTomato, ein rot fluoreszierendes Protein, ist. Dieses Reporterprotein berichtet über die Expression eines Gens von Interesse, in diesem Fall Ascl1. Mit anderen Worten, Zellen, die Ascl1 ausdrücken, werden rot. Da Ascl1 nur in RPCs⁹ exprimiert wird, ermöglicht diese Ascl1 ^CreERT:tdTomato^{STOPfl/fl-Maus} die Verfolgung der MG-Umwandlung in Ascl1-exprimierende RPCs, was bedeutet, dass die Umwandlung von Zellen rot fluoreszierendes tdTomaten-Reporterprotein exprimiert. Dies ist eine irreversible Markierung, da die DNA dieser Zellen verändert ist. Folglich wird jede nachfolgende neuronale Differenzierung visualisiert, da die tdTomato-Markierung in differenzierenden Zellen verbleibt. Wenn Ascl1-exprimierende MG-abgeleitete RPCs (mit tdTomato-Label) in Neuronen differenzieren, haben diese Neuronen immer noch ihre rote Markierung. Diese Maus ermöglicht daher nicht nur die Markierung von MG-abgeleiteten RPCs für die Live-Cell-Bildgebung, sondern ermöglicht auch die Schicksalskartierung und Abstammungsverfolgung dieser MG-abgeleiteten (roten) RPCs. In jüngerer Zeit wurde der Satz von miRNAs in RPCs identifiziert und MG-Kulturen von Ascl1^CreERT:tdTomato^STOPfl/fl RPC-Reporter-Mäusen wurden verwendet, um die Wirkung dieser miRNAs auf die Reprogrammierungskapazität und -effizienz zu screenen und zu testen²⁷. Ein Kandidat, die RPC-miRNA miR-25, wurde in der Lage befunden, kultiviertes MG in Ascl1-exprimierende (Ascl1-Tomato+) Zellen umzuprogrammieren. Diese reprogrammierten Zellen nehmen im Laufe der Zeit neuronale Merkmale an, einschließlich der neuronalen Morphologie (kleine Somata und entweder kurze oder lange Feinprozesse), der Expression neuronaler Transkripte, die über scRNA-Seq gemessen werden, sowie der Expression neuronaler Proteine, die über Immunfluoreszenzmarkierung validiert wurden²⁷.

Hier beschreibt das Protokoll, wie MG von P12-Mäusen gezüchtet und transfiziert werden kann, angepasst an die vorherige Arbeit^21,24,27. Für dieses Protokoll wurde die oben erwähnte miRNA miR-25 ausgewählt, eine miRNA, die in RPCs hoch exprimiert wird, mit niedrigen Expressionsspiegeln in MG- oder Netzhautneuronen. Um miR-25 zu überexprimieren, werden murine miR-25-Moleküle verwendet, d.h. künstliche miRNA-Moleküle. Zur Kontrolle werden Nachahmungen einer miRNA aus Caenorhabditis elegans gewählt, die in Säugetierzellen keine Funktion haben. Die Visualisierung der Umwandlung von MG in RPCs erfolgte über die RPC-Reportermaus (Ascl1^CreERT:tdTomato^STOPfl/fl), eine Maus mit gemischtem Hintergrund (C57BL/6, S129 und ICR-Dehnungen). Diese Kultur kann jedoch mit allen Mausstämmen, einschließlich Wildtyp-Stämmen, durchgeführt werden. In den letzten Jahren wurde das ursprüngliche Protokoll modifiziert, um die Dauer der Wachstumsphase und die Gesamtkulturperiode zu reduzieren und einen robusteren Gliazellenstatus zu gewährleisten und den Grad der zellulären Degeneration, die in längeren Kulturperioden auftritt, zu minimieren. Auch das reguläre Transfektionszeitfenster wurde von 3 h auf 2 Tage verlängert. Obwohl das aktuelle Protokoll MG-Kulturen als Werkzeug für Regenerationsstudien beschreibt, ist die Methode nicht nur zum Testen von Reprogrammierungsfaktoren nützlich, sondern kann auch für andere Anwendungen angepasst werden, einschließlich Studien über MG-Migrations- oder Proliferationsverhalten, Verletzungs- / Zellschadensparadigmen und / oder die Identifizierung zugrunde liegender Mechanismen und Signalwege.