MikroRNA Tedavisi Sonrası Murine Müller Glia'nın Rejenerasyon Potansiyelini İncelemek için Birincil Hücre Kültürleri

Müller glia (MG), nöral retinadaki baskın glialardır. Merkezi sinir sisteminin diğer bölgelerindeki diğer glia’lara kıyasla, su ve iyon homeostazını korumak, nöronları beslemek ve dokuyu korumak gibi benzer işlevlere sahiptirler. MG’nin başka bir büyüleyici özelliği daha vardır: olgun glia olmalarına rağmen, geç gelişim sırasında retinal progenitör hücrelerde (RPC’ler) eksprese edilen birçok geni hala eksprese ederler ^1,2. Bu benzerliğin, retina hasarından sonra balık retinasında doğal olarak oluşan MG bazlı nöronal rejenerasyonun nedeni olduğu varsayılmaktadır ^3,4. Bu işlem sırasında, MG hücre döngüsüne tekrar girer ve daha sonra altı tip retinal nöronun hepsine farklılaşan RPC’lere farklılaşır. Bu fenomen balıklarda doğal olarak meydana gelmesine rağmen, memeli MG nöronlara dönüşmez ^5,6. Bununla birlikte, yeniden programlanabilirler. MG’yi RPC’lere / nöronlara yeniden programlayan çeşitli faktörler gösterilmiştir; Bu faktörler arasında balık rejenerasyonunda rol oynayan temel sarmal-döngü-sarmal (bHLH) transkripsiyon faktörü achaete-scute homolog 1 (Ascl1) ^7,8’dir. Farelerde, Ascl1 sadece retinogenez sırasında RPC’lerde eksprese edilir, ancak olgun MG veya retinal nöronlarda^{yoktur 9}.

Hücrelerin doğrudan in vivo olarak yeniden programlanması sadece metodolojik olarak zor değil, aynı zamanda kurumsal bir hayvan bakımı ve kullanım komitesinin onayını gerektirir. Onay almak için, kullanılan veya değiştirilen faktör(ler), konsantrasyonlar, hedef dışı etkiler, altta yatan mekanizmalar, toksisite ve verimlilik hakkında ön veriler gereklidir. Hücre kültürü sistemleri, in vivo modellerde kullanılmadan önce bu kriterlerin test edilmesine izin verir. Dahası, MG tüm retinal hücre popülasyonunun sadece% 5’ini oluşturduğundan 10, MG kültürleri fonksiyonlarının 11’inin yanı sıra göç 12,13, proliferasyon 14, yaralanma / hasara stres reaksiyonu^15,16, mikroglia ¹⁷ veya retinal ganglion hücreleri (RGC’ler) gibi diğer hücre tipleriyle etkileşimleri de dahil olmak üzere davranışlarının ^{incelenmesine} izin verir. veya nörojenik potansiyelleri 19,20,21. Birçok araştırmacı, sınırsız bir proliferatif potansiyele sahip oldukları ve kolayca korunabildikleri ve transfekte edilebildikleri için çalışmaları için ölümsüzleştirilmiş hücre hatları kullanır. Bununla birlikte, birincil hücreler, biyolojik olarak ilgili analizler için ölümsüzleştirilmiş hücrelerden daha tercih edilir, çünkü gerçek hücre özelliklerine (gen ve protein ekspresyonu) sahiptirler ve daha da önemlisi, gelişimde belirli bir aşamayı temsil ederler ve bu nedenle bir “yaş” vardır. Bir hayvanın yaşı (ve dolayısıyla bir hayvandan elde edilen hücrelerin), hücresel yeniden programlamada özellikle önemli bir faktördür, çünkü hücre plastisitesi, gelişimin ilerleme aşamasıyla azalır²².

Bu protokol, primer MG’nin miRNA’larla rejenerasyonu incelemek için akım in vitro bir yöntem olarak nasıl yeniden programlanacağını ayrıntılı olarak açıklamaktadır. Bu MG birincil kültür modeli, P53 nakavt farelerde (trp53-/- fareler)23 MG’nin hücre proliferasyon özelliklerini değerlendirmek için ²⁰¹² yılında kurulmuştur. Kültürlenmiş MG’nin glial özelliklerini koruduğu (yani, immünofloresan etiketleme yoluyla değerlendirilen S100β, Pax6 ve Sox2 proteinlerinin ekspresyonu) ve in vivo MG’ye (FACS-saflaştırılmış MG’nin mikrodizisi) benzedikleri ^{gösterilmiştir23}. Kısa bir süre sonra, glial mRNA ve protein ekspresyonu, viral vektörler²⁰ kullanılarak farklı bir yaklaşımla doğrulandı ve doğrulandı. Birkaç yıl sonra, MG’ye özgü Rlbp1^CreERT:tdDomates^STOPfl/fl muhabir faresi²⁴ kullanılarak bu kültürlerde bulunan hücrelerin büyük çoğunluğunun MG olduğu doğrulandı. Dahası, hem FACS-saflaştırılmış MG hem de kültürlenmiş primer MG’deki miRNA setinin nicelleştirilmesi, MG miRNA’larının (mGLiomiR’ler) seviyelerinin, büyüme aşamasında kültürlenmiş MG’de çok fazla değişmediğini göstermiştir. Bununla birlikte, uzamış kültür dönemleri, miRNA’lar translasyonel düzenleyiciler olduğu için miRNA seviyelerinde ve dolayısıyla mRNA seviyelerinde ve protein ekspresyonunda değişikliklere neden olur²⁵.

2013 yılında, bu MG kültür modeli, MG’yi retinal nöronlara yeniden programlama yeteneklerine göre çeşitli transkripsiyon faktörlerini test etmek için kullanılmıştır²⁰. Ascl1’in çok sağlam ve güvenilir bir yeniden programlama faktörü olduğu bulunmuştur. Ascl1’in viral vektörler yoluyla aşırı ekspresyonu, morfolojik değişikliklere, nöronal belirteçlerin ekspresyonuna ve nöronal elektrofizyolojik özelliklerin kazanılmasına neden olmuştur. Daha da önemlisi, bu ilk in vitro deneylerden elde edilen içgörüler ve sonuçlar, primer MG kültürlerinin in vivo uygulamadan önce ilk faktör taramaları ve glial özelliklerin değerlendirilmesi için sağlam ve güvenilir bir araç olduğunu gösteren ^22,26 in vivo uygulamalara başarıyla aktarılmıştır.

Birkaç yıl önce, retinal nöronlarda da yüksek oranda eksprese edilen beyinle zenginleştirilmiş miRNA miR-124’ün, kültürlü MG^21’de Ascl1 ekspresyonunu indükleyebileceği gösterilmiştir. Canlı hücrelerdeki Ascl1 ekspresyonu, bir Ascl1 muhabir faresi (Ascl1^CreERT:tdDomates^STOPfl/fl) aracılığıyla görselleştirildi. Bir muhabir faresi, DNA’sına yerleştirilmiş bir muhabir genine sahip genetik olarak tasarlanmış bir faredir. Bu muhabir geni, bu çalışmada kırmızı bir floresan proteini olan tdTomato’da bulunan bir muhabir proteinini kodlar. Bu muhabir proteini, ilgilenilen bir genin, bu durumda, Ascl1’in ekspresyonunu bildirir. Başka bir deyişle, Ascl1’i eksprese eden hücreler kırmızıya döner. Ascl1 yalnızca RPC^9’da ifade edildiğinden, bu Ascl1 ^CreERT: tdDomates^{STOPfl / fl} faresi, MG dönüşümünün RPC’leri ifade eden Ascl1’e dönüştürülmesinin izlenmesine izin verir, yani dönüştürücü hücreler kırmızı floresan tdDomates raporlayıcı proteinini ifade edecektir. Bu, bu hücrelerin DNA’sı değiştirildiği için geri dönüşümsüz bir etiketlemedir. Sonuç olarak, sonraki herhangi bir nöronal farklılaşma görselleştirilecektir, çünkü tdDomates etiketi farklılaşan hücrelerde kalır. MG kaynaklı RPC’leri (tdDomates etiketli) ifade eden Ascl1 nöronlara farklılaşırsa, bu nöronlar hala kırmızı etiketlerine sahip olacaktır. Bu nedenle, bu fare, yalnızca MG türevli RPC’lerin canlı hücre görüntüleme için etiketlenmesine izin vermekle kalmaz, aynı zamanda bu MG türevi (kırmızı) RPC’lerin kader haritalamasına ve soy izlemesine de izin verir. Daha yakın zamanlarda, RPC’lerdeki miRNA seti tanımlandı ve bu miRNA’ların yeniden programlama kapasitesi ve verimliliği üzerindeki etkisini taramak ve test etmek için Ascl1^CreERT:tdTomato^{STOPfl / fl} RPC-reporter farelerin MG kültürleri kullanıldı²⁷. Bir aday, RPC-miRNA miR-25, kültürlenmiş MG’yi Ascl1 eksprese eden (Ascl1-Domates +) hücrelere yeniden programlayabildiği bulundu. Bu yeniden programlanmış hücreler, nöronal morfoloji (küçük somata ve kısa veya uzun ince süreçler), scRNA-Seq ile ölçülen nöronal transkriptlerin ekspresyonu ve immünofloresan etiketleme²⁷ ile doğrulanan nöronal proteinlerin ekspresyonu dahil olmak üzere zamanla nöronal özellikleri benimser.

Burada, protokol, önceki çalışma^{21,24,27’den} uyarlanmış P12 farelerinden ^MG’nin nasıl yetiştirileceğini ve transfekte edileceğini detaylandırıyor. Bu protokol için seçilen, yukarıda belirtilen miRNA miR-25, RPC’lerde yüksek oranda eksprese edilen, MG veya retinal nöronlarda düşük ekspresyon seviyelerine sahip bir miRNA’dır. MiR-25’i aşırı eksprese etmek için murin miR-25 taklitleri, yani yapay miRNA molekülleri kullanılır. Kontrol olarak, Caenorhabditis elegans’tan bir miRNA’nın taklitleri, memeli hücrelerinde hiçbir işlevi olmayan seçilir. MG’nin RPC’lere dönüşümünün görselleştirilmesi, RPC muhabir faresi (Ascl1^CreERT:tdDomates^STOPfl/fl), karışık arka plana sahip bir fare (C57BL/6, S129 ve ICR suşları) ile gerçekleştirildi. Bununla birlikte, bu kültür, vahşi tip suşlar da dahil olmak üzere tüm fare suşlarıyla gerçekleştirilebilir. Son birkaç yılda, orijinal protokol, büyüme fazı süresini ve genel kültür dönemini azaltmak ve daha sağlam bir glia hücresi durumu sağlamak ve uzun kültür dönemlerinde meydana gelen hücresel dejenerasyon derecesini en aza indirmek için değiştirilmiştir. Düzenli transfeksiyon süresi de 3 saatten 2 güne uzatıldı. Daha önce de belirtildiği gibi, mevcut protokol MG kültürlerini rejenerasyon çalışmaları için bir araç olarak tanımlasa da, yöntem sadece yeniden programlama faktörlerini test etmek için yararlı değildir, aynı zamanda MG göçü veya proliferatif davranışı, yaralanma / hücre hasarı ile ilgili paradigmalar ve / veya altta yatan mekanizmaların ve yolların tanımlanması ile ilgili çalışmalar da dahil olmak üzere diğer uygulamalar için de uyarlanabilir.