Первичные клеточные культуры для изучения потенциала регенерации мышиной глии Мюллера после лечения микроРНК

Мюллеровская глия (MG) является преобладающей глией в нервной сетчатке. Они имеют аналогичные функции по сравнению с другими глиями в других частях центральной нервной системы, таких как поддержание водного и ионного гомеостаза, питание нейронов и защита тканей. У MG есть еще одна увлекательная особенность: хотя они являются зрелыми глиями, они все еще экспрессируют многие гены, экспрессируемые в клетках-предшественниках сетчатки (RPC) во время позднего развития ^1,2. Предполагается, что это сходство является причиной естественной регенерации нейронов на основе MG в сетчатке рыб после повреждения сетчатки ^3,4. Во время этого процесса MG повторно входят в клеточный цикл и дедифференцируются в RPC, которые затем дифференцируются во все шесть типов нейронов сетчатки. Хотя это явление встречается естественным образом у рыб, МГ млекопитающих не превращаются в нейроны ^5,6. Однако они могут быть перепрограммированы. Было показано, что различные факторы перепрограммируют MG в RPC/ нейроны; среди этих факторов — основной фактор транскрипции спираль-петля-спираль (bHLH) achaete-scute homolog 1 (Ascl1), который участвует в регенерации рыб ^7,8. У мышей Ascl1 экспрессируется только в RPC во время ретиногенеза, но отсутствует в зрелых MG или нейронах сетчатки⁹.

Перепрограммирование клеток непосредственно in vivo является не только методологически сложной задачей, но и требует одобрения институционального комитета по уходу за животными и их использованию. Для получения одобрения требуются предварительные данные об используемом или измененном факторе (факторах), концентрациях, нецелевых эффектах, основных механизмах, токсичности и эффективности. Системы клеточных культур позволяют тестировать эти критерии перед использованием в моделях in vivo. Более того, поскольку МГ составляют только около 5% всей популяции клеток сетчатки¹⁰, культуры МГ позволяют изучать их функцию¹¹, а также их поведение, включая миграцию^12,13, пролиферацию¹⁴, стрессовую реакцию на травму / повреждение^15,16, их взаимодействие с другими типами клеток, такими как микроглия¹⁷ или ганглиозные клетки сетчатки (RGC)¹⁸, или их нейрогенный потенциал 19,20,21. Многие исследователи используют увековеченные клеточные линии для своих исследований, поскольку они имеют неограниченный пролиферативный потенциал и могут легко поддерживаться и трансфицироваться. Первичные клетки, однако, предпочтительнее для биологически значимых анализов, чем увековеченные клетки, поскольку они имеют истинные клеточные характеристики (экспрессия генов и белков) и, что более важно, они представляют собой определенную стадию развития и, следовательно, имеют «возраст». Возраст животного (и, следовательно, клеток, полученных от животного) является особенно важным фактором в клеточном перепрограммировании, поскольку пластичность клеток уменьшается с прогрессирующей стадией развития²².

Этот протокол подробно описывает, как перепрограммировать первичный МГ с миРНК в качестве текущего метода in vitro для изучения регенерации. Эта модель первичной культуры MG была создана в 2012 году для оценки характеристик пролиферации клеток MG у нокаутирующих мышей P53 (trp53-/- мышей)²³. Было показано, что культивируемые МГ сохраняют свои глиальные свойства (т.е. экспрессию белков S100β, Pax6 и Sox2, оцененных с помощью иммунофлуоресцентной маркировки), и что они напоминают in vivo MG (микрочип ОЧИЩЕННОГО FACS MG)²³. Вскоре после этого глиальная мРНК и экспрессия белка были проверены и подтверждены в другом подходе с использованием вирусных векторов²⁰. Несколько лет спустя было подтверждено, что подавляющее большинство клеток, обнаруженных в этих культурах, являются MG с помощью MG-специфической Rlbp1^CreERT: tdTomato^{STOPfl / fl} репортерной мыши²⁴. Кроме того, количественная оценка набора миРНК как в FACS-очищенных МГ, так и в культивируемых первичных МГ показала, что уровни МГ миРНК (mGLiomiRs) не сильно различаются в культивируемых МГ во время фазы роста. Однако удлиненные периоды культивирования вызывают изменения в уровнях миРНК и, следовательно, в уровнях мРНК и экспрессии белка, поскольку миРНК являются трансляционными регуляторами²⁵.

В 2013 году эта модель культуры MG была использована для тестирования различных факторов транскрипции в отношении их способности перепрограммировать MG в нейроны сетчатки²⁰. Ascl1 оказался очень надежным и надежным фактором перепрограммирования. Сверхэкспрессия Ascl1 через вирусные векторы индуцировала морфологические изменения, экспрессию нейронных маркеров и приобретение нейрональных электрофизиологических свойств. Что еще более важно, идеи и результаты, полученные в результате этих первых экспериментов in vitro, были успешно перенесены в приложения in vivo ^22,26, демонстрируя, что первичные культуры MG представляют собой надежный и надежный инструмент для скрининга начальных факторов и оценки глиальных признаков до реализации in vivo.

Несколько лет назад было показано, что обогащенная мозгом миРНК miR-124, которая также высоко экспрессируется в нейронах сетчатки, может индуцировать экспрессию Ascl1 в культивируемом MG²¹. Экспрессия Ascl1 в живых клетках визуализировалась с помощью репортерской мыши Ascl1 (Ascl1^CreERT:tdTomato^STOPfl/fl). Мышь-репортер — это генетически модифицированная мышь, в ДНК которой вставлен ген репортера. Этот ген-репортер кодирует репортерный белок, который находится в этом исследовании tdTomato, красный флуоресцентный белок. Этот белок-репортер сообщает о экспрессии интересующего гена, в данном случае Ascl1. Другими словами, клетки, которые экспрессируют Ascl1 , станут красными. Поскольку Ascl1 экспрессируется только в RPC⁹, эта мышь Ascl1^CreERT:tdTomato^STOPfl/fl позволяет отслеживать преобразование MG в Ascl1 , экспрессирующие RPC, что означает, что преобразующие клетки будут экспрессировать красный флуоресцентный tdTomato репортерный белок. Это необратимая маркировка, так как ДНК этих клеток изменяется. Следовательно, любая последующая дифференцировка нейронов будет визуализирована, потому что метка tdTomato остается в дифференцирующих клетках. Если Ascl1 , экспрессирующие RPC, полученные из MG (с меткой tdTomato), дифференцируются в нейроны, эти нейроны все равно будут иметь свою красную метку. Таким образом, эта мышь позволяет не только маркировать RPC, полученные из MG, для визуализации живых клеток, но также позволяет картировать судьбу и отслеживать родословную этих MG-производных (красных) RPC. Совсем недавно был идентифицирован набор миРНК в RPC и MG культуры Ascl1^CreERT:tdTomato^STOPfl/fl RPC-репортерных мышей были использованы для скрининга и тестирования влияния этих микроРНК на способность перепрограммирования и эффективность²⁷. Было обнаружено, что один из кандидатов, RPC-miRNA miR-25, способен перепрограммировать культивируемый MG в клетки, экспрессирующие Ascl1 (Ascl1-Tomato+). Эти перепрограммированные клетки со временем принимают нейронные особенности, включая морфологию нейронов (малые соматы и короткие или длинные тонкие процессы), экспрессию нейронных транскриптов, измеренных с помощью scRNA-Seq, а также экспрессию нейронных белков, подтвержденных с помощью иммунофлуоресцентной маркировки²⁷.

Здесь протокол подробно описывает, как выращивать и трансфектировать MG от мышей P12, адаптированных из предыдущей работы 21,24,27. Для этого протокола выбрана вышеупомянутая miRNA miR-25, миРНК, высоко экспрессируемая в RPC, с низкими уровнями экспрессии в MG или нейронах сетчатки. Для сверхэкспрессии miR-25 используется мышиная имитация miR-25, т.е. искусственные молекулы миРНК. В качестве контроля выбраны имитации миРНК из Caenorhabditis elegans, которые не имеют функции в клетках млекопитающих. Визуализация преобразования MG в RPC осуществлялась с помощью RPC-репортерной мыши (Ascl1^CreERT:tdTomato^STOPfl/fl), мыши со смешанным фоном (штаммы C57BL/6, S129 и ICR). Эта культура, однако, может быть выполнена со всеми штаммами мышей, включая штаммы дикого типа. В последние несколько лет оригинальный протокол был изменен для сокращения продолжительности фазы роста и общего периода культивирования и обеспечения более надежного статуса клеток глии и минимизации степени клеточной дегенерации, которая происходит в длительные периоды культивирования. Обычное временное окно трансфекции также было продлено с 3 ч до 2 дней. Как упоминалось ранее, хотя текущий протокол описывает культуры MG как инструмент для исследований регенерации, метод не только полезен для тестирования факторов перепрограммирования, но также может быть адаптирован для других применений, включая исследования о миграционном или пролиферативном поведении MG, парадигмах, связанных с повреждением травм / клеток, и / или идентификации основных механизмов и путей.