Un microscope photoacoustique ultraviolet à grande vitesse et à toit ouvert capable de fournir des images histologiques en peropératoire pour l’analyse chirurgicale des marges est démontré, y compris la configuration du système, l’alignement optique, la préparation des échantillons et les procédures expérimentales.
L’analyse de marge chirurgicale (SMA), une procédure essentielle pour confirmer l’excision complète du tissu cancéreux en chirurgie de résection tumorale, nécessite des outils de diagnostic peropératoire pour éviter les chirurgies répétées en raison d’une marge chirurgicale positive. Récemment, en tirant parti de la haute absorption optique intrinsèque de l’ADN / ARN à une longueur d’onde de 266 nm, la microscopie photoacoustique ultraviolette (UV-PAM) a été développée pour fournir des images histologiques à haute résolution sans marquage, ce qui montre de grandes promesses en tant qu’outil peropératoire pour la SMA. Pour permettre le développement d’UV-PAM pour SMA, un système UV-PAM à grande vitesse et à toit ouvert est présenté, qui peut être utilisé de la même manière que les microscopies optiques conventionnelles. Le système UV-PAM offre une résolution latérale élevée de 1,2 μm et une vitesse d’imagerie élevée de 55 kHz avec un balayage du miroir galvanométrique à un axe. De plus, pour s’assurer que les images UV-PAM peuvent être facilement interprétées par les pathologistes sans formation supplémentaire, les images UV-PAM originales en niveaux de gris sont virtuellement colorées par un algorithme d’apprentissage en profondeur pour imiter les images standard colorées à l’hématoxyline et à l’éosine, permettant une analyse histologique sans formation. L’imagerie des tranches cérébrales de souris est réalisée pour démontrer les hautes performances du système UV-PAM à toit ouvert, illustrant son grand potentiel pour les applications SMA.
L’analyse chirurgicale de la marge (AMS), qui nécessite un examen des échantillons de tissus au microscope, est une procédure essentielle pour déterminer si toutes les cellules cancéreuses sont retirées du corps d’un patient lors d’une chirurgie de résection1. Par conséquent, un microscope capable de fournir rapidement des images histologiques est d’une importance vitale pour la SMA afin d’éviter les chirurgies répétées causées par l’ablation incomplète des cellules cancéreuses. Cependant, selon la méthode actuelle de référence basée sur la microscopie optique à champ lumineux, le tissu excisé doit être fixé dans du formol, incorporé dans de la paraffine, sectionné en fines tranches (4-7 μm), puis coloré par l’hématoxyline et l’éosine (H & E) avant l’imagerie, ce qui prend du temps (3-7 jours) et est laborieux 2,3 . Une section congelée est une alternative rapide à la SMA en congelant, tranchant et colorant rapidement le tissu, ce qui peut fournir des images histologiques en 20-30 min4. Cependant, les caractéristiques histologiques sont souvent déformées et nécessitent une formation habile, ce qui entrave l’applicabilité de la technique à plusieurs types d’organes5.
Des techniques de microscopie optique capables de fournir des images cellulaires sans ou avec quelques étapes de traitement des tissus ont été développées pour la SMA. Cependant, chacun d’eux souffre de problèmes différents. Par exemple, la tomographie par cohérence optique6 et la microscopie à réflectance confocale7 souffrent d’une faible spécificité en raison de leur faible contraste de diffusion intrinsèque. Bien que la microscopie avec excitation de surface ultraviolette8 et la microscopie à feuille de lumière9 puissent fournir des images à haute résolution et à contraste élevé pour la SMA, la procédure de coloration toxique et volatile ne peut généralement pas être effectuée dans une salle d’opération, ce qui prolonge le délai d’exécution. La microscopie multiphotonique10 et la microscopie Raman stimulée11 peuvent fournir des informations riches pour la SMA. Pourtant, le coût élevé des lasers ultrarapides requis qui sont utilisés pour générer des effets non linéaires empêche leur large applicabilité.
Récemment, en tirant parti de l’absorption optique intrinsèque, la microscopie photoacoustique ultraviolette sans étiquette (UV-PAM) a été développée pour fournir des images histologiques à haute résolution12. Dans l’UV-PAM, l’énergie photonique de la lumière UV d’excitation (par exemple, 266 nm) est d’abord absorbée par l’ADN/ARN dans les noyaux cellulaires13 , puis convertie en chaleur, induisant l’émission d’ondes acoustiques par expansion thermo-élastique14. En détectant les ondes acoustiques générées, des images UV-PAM bidimensionnelles (2D) des noyaux cellulaires peuvent être obtenues via une projection d’amplitude maximale des signaux acoustiques, fournissant des informations histologiques pour la SMA. Pour permettre les applications cliniques de l’UV-PAM, un UV-PAM à grande vitesse basé sur le balayage du miroir galvanométrique a été développé pour fournir des images histologiques pour un échantillon de biopsie cérébrale (5 mm x 5 mm) en 18 min, montrant un grand potentiel dans les applications sensibles au temps15. Pour valider davantage la possibilité d’UV-PAM pour l’imagerie des tissus épais, un système UV-PAM en mode réflexion avec un scanner de systèmes microélectromécaniques à un axe étanche a été proposé, démontrant avec succès l’examen histopathologique peropératoire des tissus du côlon et du foie humains16. Étant donné que l’image UV-PAM originale est en niveaux de gris tandis que l’image colorée H& E de référence est en couleurs rose et violet, il est difficile pour les pathologistes d’interpréter directement les images UV-PAM. Pour résoudre ce problème, un algorithme d’apprentissage en profondeur a été proposé pour transférer des images UV-PAM en niveaux de gris dans des images virtuelles colorées H & E en temps quasi réel afin que les pathologistes puissent comprendre les images sans aucune formation supplémentaire17.
Ce travail rapporte un système UV-PAM à grande vitesse et à toit ouvert qui peut être utilisé de la même manière que les microscopies optiques conventionnelles, fournissant à la fois des images histologiques originales en niveaux de gris et des images virtuellement colorées assistées par un algorithme d’apprentissage en profondeur. Une tranche de cerveau de souris fixée au formol et incorporée à la paraffine (FFPE) est imagée par le système UV-PAM pour démontrer la similitude entre nos images UV-PAM virtuellement colorées et les images standard colorées H & E, montrant son potentiel pour les applications SMA.
En résumé, un système UV-PAM à grande vitesse et à toit ouvert a été démontré pour l’imagerie histologique. Les instructions détaillées sur la configuration du système, l’alignement optique, la préparation des échantillons et les procédures expérimentales sont présentées. Le programme d’acquisition d’images est accessible à partir de Github via le lien fourni dans la table des matériaux. La résolution latérale du système actuel est d’environ 1,2 μm qui a été mesurée expérimentalement dans une publication récente21. Une tranche de cerveau de souris a été imagée pour démontrer que le système actuel peut obtenir une image histologique en 18 minutes pour une zone de 5 x 5 mm2, ce qui est une taille typique de la biopsie cérébrale22. Bien que l’image originale soit en niveaux de gris, à l’aide d’un outil de coloration virtuel numérique activé par un algorithme d’apprentissage en profondeur, le système actuel peut en outre fournir des images virtuellement colorées en temps quasi réel, assurant une adaptation facile pour les pathologistes à interpréter les images. En tant que technique d’image sans étiquette, le système UV-PAM actuel peut également fournir des images histologiques pour des échantillons de tissus frais non traités. D’autres exemples (y compris des échantillons de tissus congelés et frais) ont été démontrés dans une publication précédente17. Les résultats expérimentaux montrent le potentiel élevé du système UV-PAM assisté par apprentissage profond actuel dans les applications SMA.
L’un des avantages du système UV-PAM est que le système est mis en œuvre en mode réflexion, permettant l’imagerie de tissus épais. En outre, le système UV-PAM à toit ouvert permet de placer l’échantillon sur la fenêtre de balayage (la membrane du réservoir d’échantillons), qui a un fonctionnement similaire à celui des microscopies optiques traditionnelles. Par conséquent, ce système est plus convivial que d’autres systèmes qui nécessitent que les échantillons soient pris en sandwich par deux membranes11,14. De plus, en utilisant un GM 1D avec un laser UV à haut taux de répétition, le système UV-PAM actuel peut atteindre une vitesse d’imagerie élevée avec une rentabilité plus élevée par rapport au système utilisant l’excitation multifocale23.
Actuellement, la vitesse d’imagerie est principalement limitée par le taux de répétition du laser et le budget de photons. Avec un laser qui a un taux de répétition élevé et une énergie d’impulsion élevée, le temps d’imagerie peut être encore raccourci. Une autre limitation du système est que l’échantillon ne peut être ajusté grossièrement au plan focal de l’objectif qu’en trouvant les signaux de sonorisation maximaux, au lieu d’afficher une image en temps réel pour que les utilisateurs puissent visualiser si l’échantillon est au point. Pour afficher une image en temps quasi réel, 2D GM peut être appliqué.
Il y a deux étapes critiques dans le protocole: (a) l’exigence confocale des foyers optiques et acoustiques doit être optimisée pour atteindre une sensibilité de détection élevée; b) la plage de balayage du GM sur l’axe des x doit être inférieure à la focale acoustique de l’UT en forme d’anneau pour maintenir une sensibilité de détection élevée similaire (dans la configuration actuelle, la plage de balayage est d’environ 30 μm ±15 μm). Sinon, des effets de vignettage évidents sur les bords se produiraient lorsque plusieurs sous-images sont assemblées pour obtenir une image entière.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs tiennent à remercier la Commission de l’innovation et de la technologie de Hong Kong pour son soutien financier (ITS/036/19).
Alcohol | Sigma Aldrich | PHR1373 | Sample dehydration |
Amplifier | Mini Circuit | ZFL-500LN-BNC+ | Ultrasonic signal amplification |
Controller | National Instruments | NI myRIO | System controller |
Data acquisition card | Alazar Technologies | ATS9350 | Ultrasonic signal collection |
Deep-learning algorithm | For transfering the grayscale UV-PAM image to a virtual H&E-stained image; https://github.com/TABLAB-HKUST/Deep-PAM | ||
Formalin | Sigma Aldrich | R04586 | Sample fixation |
H&E staining kit | Abcam | ab245880 | Sample staining |
Histo-Clear II | National Diagnostics | HS-202 | Sample deparaffinization |
Image acquisition program | National Instruments | LabVIEW | Lab-built program using LabVIEW; https://github.com/TABLAB-HKUST/LabVIEW-program-for-UV-PAM |
Image processing algorithm | Mathworks | MATLAB | Lab-built algorithm using MATLAB; https://github.com/TABLAB-HKUST/ImageRec_GM-UVPAM |
Kinematic platform mounts | Thorlabs | KM200B | Adjust the sample to be flat |
Membrane | Glad | Cling wrap | Sandwiched in sample tank |
Microscope objective lens | Thorlabs | LMU- 5X-NUV | Objective lens |
Motorized stages | Physik Instrumente | L-509.10SD00 | Scanning stages |
One-dimensional galvanometer mirror | Thorlabs | GVS411 | Fast scanning mirror |
Oscilloscope | RIGOL Technologies | DS1102E | Ultrasonic signal readout |
Phosphate-buffered saline | Sigma Aldrich | P3813 | Sample washing |
Pinhole | Edmund Optics | #59–257 | Spatial filtering |
Plano convex lens | Thorlabs | LA-4600-UV | Focusing lens |
Plano convex lens | Thorlabs | LA-4663-UV | Collimating lens |
Pulser/receiver | Imaginant | DPR300 | Pulse echo amplifier |
Q-switch diode-pumped solid-state laser | Bright Solutions | WEDGE HF 266 nm | 266-nm laser |
Ring-shaped ultrasonic transducer | University of Southern California | Ultrasonic signal detection | |
Sample holder | Lab-made | Hold the sample tank | |
Sample tank | Lab-made | Hold biological samples | |
Single-axis Z-translational stage | Thorlabs | PT1 | Manual stage |
Two-axis manual stage | Thorlabs | LX20 | Manual stage |
Water tank | Lab-made | Ultrasonic signal transmission | |
Xylene | Sigma Aldrich | XX0060 | Sample clearing |