Высокоскоростная ультрафиолетовая фотоакустическая микроскопия для гистологической визуализации с виртуальным окрашиванием с помощью глубокого обучения

Все эксперименты на животных, выполненные в этой работе, одобрены Комитетом по этике животных в Гонконгском университете науки и технологии. 1. Система UV-PAM с открытым верхом (рисунок 1) Оптическая подсветка Используйте твердотельный лазер с диодной накачкой Q-switch (длина волны 266 нм) в качестве источника возбуждения. Используйте две выпуклые линзы для расширения лазерного луча и поместите точечное отверстие близко к фокусной точке первой выпуклой линзы для выполнения пространственной фильтрации. Отражайте лазерный луч вверх с помощью 1D-зеркала гальванометра (1D GM). Используйте объектив для фокусировки лазерного луча и прохождения через центр кольцеобразного ультразвукового преобразователя (UT), прежде чем быть плотно сфокусированным на образце. Ультразвуковое обнаружение Используйте кольцеобразный сфокусированный UT для обнаружения ультразвуковых волн. Внутренний и наружный диаметры активной области UT составляют 3 мм и 6 мм соответственно. Фокусное расстояние: 6.3 mm; центральная частота: 40 МГц; Полоса пропускания -6 дБ: 84%. Закрепите UT в лабораторном резервуаре для воды с оптически прозрачным окном внизу, покрытым тонким кварцевым чехлом, чтобы пропускать ультрафиолетовый свет. Убедитесь, что активная область UT обращена вверх. Прикрепите резервуар для воды к двухосевой ручной ступени для управления боковым положением UT. Включите УФ-лазер, отрегулируйте положение UT, чтобы лазерный луч проходил от центра UT. Выключите УФ-лазер. Затем заполните резервуар для воды деионизированной водой, чтобы полностью погрузить UT. Подключите выход UT к двум усилителям (суммарный коэффициент усиления = 56 дБ) и подключите выход второго усилителя к карте сбора данных (DAQ). Прикрепите держатель образца к ручной ступени по оси Z, которая соединена с xy-моторизованными ступенями. Держатель образца имеет пустое отверстие, которое пропускает ультрафиолетовый свет. Прикрепите четыре куска двусторонней ленты, окружающей отверстие. Выравнивание системы Прикрепите черную ленту к стеклянному слайду и поместите стеклянную заслонку, чтобы покрыть отверстие держателя образца, а черную ленту повернуть вниз. Нажмите на стеклянный слайд, чтобы убедиться, что он закреплен на держателе образца. Затем опустите держатель образца, чтобы погрузить стекло в воду. Отсоедините кольцеобразный UT и усилители, подключите UT к импульсу/приемнику и подключите выход импульса/приемника к осциллографу. Переведите импульс/приемник в режим Pulse-Echo. Установите амплитуду импульса и коэффициент усиления импульса/приемника на 6 и 20 дБ соответственно. Включите импульс/приемник и отрегулируйте z-положение держателя образца, чтобы найти положение акустической фокальной плоскости, где ультразвуковые сигналы максимальны. Переключите импульс/приемник в режим передачи и установите коэффициент усиления на 60 дБ. Включите лазерный выход. Отрегулируйте z-положение объектива, чтобы максимизировать сигналы ПА, измеряемые осциллографом. Отрегулируйте боковое положение кольцеобразного UT, чтобы сделать генерируемый сигнал ПА симметричным и максимальным, что означает, что оптический и акустический фокусы объединены в боковой плоскости. Затем отрегулируйте z-положение держателя образца, чтобы максимизировать сигналы PA. Повторите шаги 1.4.3 и 1.4.4 для оптимизации симметрии и амплитуды сигналов ПА. Запишите временную задержку (т.е. время, необходимое для того, чтобы волны ПА достигли UT) на осциллографе, когда сигналы ПА оптимизированы. Переместите держатель образца в различные положения черной ленты. Отрегулируйте плоскостность держателя образца таким образом, чтобы сигналы ПА, генерируемые из каждого положения черной ленты, имели такую же временную задержку, как и измеренная на этапе 1.4.5. Выключите лазер и подключите UT к двум усилителям. 2. Пробоподготовка Срез мозга мыши FFPE Приносят в жертву мышь при передозировке анестезии. Затем соберите мозг мыши в соответствии с протоколом, описанным в ссылке18. Зафиксируйте собранный мозг в 10% нейтральном буферизованном формалине в течение 24 ч. Обработать неподвижный мозг путем обезвоживания градуированным спиртом, очистки ксилолом и встраивания парафином, как описано в ссылке19.ПРИМЕЧАНИЕ: Обработайте образец в вытяжном шкафу. Нарежьте встроенный мозг тонкими ломтиками (толщиной 5 мкм) с помощью микротома. Поместите срезы образца на кварцевые слайды. Высушите горки в духовке при 60 °C в течение 1 ч. Депарафинизируйте участки с помощью очищающего агента (см. Таблицу материалов), который удаляет парафин, чтобы избежать высоких фоновых сигналов, поскольку парафин сильно поглощается при УФ-возбуждении.ПРИМЕЧАНИЕ: Обработайте образец в вытяжном шкафу. Свежий срез мозга мыши Приносят в жертву мышь при передозировке анестезии. Затем соберите мозг мыши в соответствии с протоколом, указанным в ссылке18. Промыть мозг мыши фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) для удаления крови. Вырежьте кусочек образца мозга (толщиной ~ 5 мм) вручную, а затем промыте образец PBS, чтобы удалить кровь на поперечном сечении. 3. Экспериментальные процедуры Размещение образцов Подготовьте лабораторный резервуар для образцов с прозрачной УФ-мембраной (полиэтилен, толщина ∼10 мкм). Добавьте каплю воды к мембране, а затем поместите биологический образец в резервуар для образцов, чтобы покрыть воду. В случае образца среза FFPE используйте ленту для фиксации стеклянного слайда на мембране. Поместите резервуар для проб, содержащий образец, на держатель для образцов, обеспечив закрытие пустого отверстия держателя для образцов. Установите УФ-лазер в режим внешнего триггера. С помощью нашей лабораторной программы LabVIEW (см. Таблицу материалов) задайте параметры сканирования следующим образом. Установить частоту повторения лазера на 55 кГц; установить тип сигналаe драйвера GM на треугольный , а диапазон напряжения привода на 0,018 В (представляющий ±0,018 В; коэффициент масштабирования: 1 В/°). Установите GMnum на 22 и dy на 2 так, чтобы после каждых 22 лазерных триггеров GM заканчивал четверть периода сканирования, а двигатель по оси Y перемещал шаг размером 0,3125 мкм. Установите dx равным 192 таким образом, чтобы, когда двигатель по оси Y достигает заданного положения (например, 5 мм), двигатель по оси X перемещался с шагом 30 мкм.ПРИМЕЧАНИЕ: Наименьший размер шага приращения установлен равным 0,15625 мкм для двигателей по осям x и y. Поэтому, когда dy = 2, размер шага равен 0,15625 x 2 = 0,3125 мкм, а когда dx = 192, размер шага равен 0,15625 x 192 = 30 мкм. Чтобы отсканировать всю площадь 5 х 5мм2, двигатель оси X будет перемещаться на 5000 мкм / 30 мкм = 167 раз, что означает, что для получения целого изображения будет сшито 167 подизображений. На рисунке 2 показана траектория сканирования системы UV-PAM. Начните пробное сканирование на небольшой области, установив количество движущихся шагов двигателей по осям x и y (xn = 10 и yn = 1000). Отрегулируйте ручной каскад по оси Z, чтобы поместить образец на фокальную плоскость для получения максимальных сигналов PA. Переместите двигатели по осям x и y в нужную начальную точку, задайте область сканирования, установив значения xn и yn , а затем запустите программу получения изображений (см. Таблицу материалов). После получения изображения выключите лазер, извлеките держатель образца и сохраните биологические образцы. Для свежих биологических тканей храните образцы в 10% нейтральном буферизованном формалине. Для срезов мозга мыши FFPE окрашивают H&E в соответствии с протоколом, указанным в ссылке20 , для получения соответствующих изображений, окрашенных H&E. Используйте собранные сигналы ПА для реконструкции максимального амплитудного проекционного изображения с использованием лабораторного алгоритма обработки изображений (см. Таблицу материалов).