Microscopia fotoacústica ultravioleta de alta velocidade para imagem histológica com coloração virtual assistida pelo Deep Learning

Todos os experimentos em animais realizados neste trabalho são aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Ciência e Tecnologia de Hong Kong. 1. Sistema UV-PAM de topo aberto (Figura 1) Iluminação óptica Use um laser de estado sólido bombeado por diodo Q (comprimento de onda de 266 nm) como fonte de excitação. Use duas lentes convexas para expandir o raio laser e coloque um orifício perto do ponto focal da primeira lente convexa para realizar filtragem espacial. Reflita o raio laser para cima usando um espelho galvanômetro 1D (1D GM). Use uma lente objetiva para focar o raio laser e passe pelo centro de um transdutor ultrassônico em forma de anel (UT) antes de ser fortemente focado em uma amostra. Detecção ultrassônica Use um UT focado em anel para detectar ondas ultrassônicas. Os diâmetros internos e externos da área ativa ut são de 3 mm e 6 mm, respectivamente. Distância focal: 6,3 mm; frequência central: 40 MHz; -6 dB largura de banda: 84%. Fixar o UT em um tanque de água feito em laboratório com uma janela opticamente transparente na parte inferior, coberta por uma fina tampa de quartzo para permitir que a luz UV passe. Certifique-se de que a área ativa do UT está voltada para cima. Fixar o reservatório de água a um estágio manual de dois eixos para controlar a posição lateral do UT. Ligue o laser UV, ajuste a posição do UT para permitir que o raio laser passe pelo centro da UT. Desligue o laser UV. Em seguida, encha o reservatório de água com água desionizada para imergir totalmente o UT. Conecte a saída do UT a dois amplificadores (ganho total = 56 dB) e conecte a saída do segundo amplificador a uma placa de aquisição de dados (DAQ). Conecte um suporte de amostra a um estágio manual de eixo z conectado a estágios motorizados por xy. O porta-amostras tem um orifício vazio que permite a passagem da luz UV. Anexar quatro pedaços de fita dupla face ao redor do buraco. Alinhamento do sistema Conecte a fita preta a um slide de vidro e coloque o slide de vidro para cobrir o orifício do suporte da amostra, com a fita preta voltada para baixo. Pressione o slide de vidro para garantir que ele esteja fixado no suporte da amostra. Em seguida, baixe o suporte de amostra para imergir o deslizamento de vidro na água. Desconecte o UT em forma de anel e os amplificadores, conecte o UT ao pulser/receptor e conecte a saída do pulsador/receptor a um osciloscópio. Opere o pulsar/receptor no modo Pulse-Echo. Defina a amplitude de pulso e o ganho do pulser/receptor para 6 e 20 dB, respectivamente. Habilite o pulser/receptor e ajuste a posição z do suporte da amostra para encontrar a posição do plano focal acústico onde os sinais ultrassônicos são máximos. Altere o pulser/receptor para o modo de transmissão e ajuste o ganho para 60 dB. Habilite a saída do laser. Ajuste a posição z da lente objetiva para maximizar os sinais de AF que são medidos pelo osciloscópio. Ajuste a posição lateral do UT em forma de anel para tornar o sinal de PA gerado simétrico e máximo, o que representa que os focos ópticos e acústicos são coalhados no plano lateral. Em seguida, ajuste a posição z do suporte de amostra para maximizar os sinais de AF. Repita as etapas 1.4.3 e 1.4.4 para otimizar tanto a simetria quanto a amplitude dos sinais pa. Registo o tempo de atraso (ou seja, o tempo que leva para as ondas de PA atingirem o UT) no osciloscópio quando os sinais de PA são otimizados. Mova o suporte de amostra para imagem de diferentes posições da fita preta. Ajuste o achatamento do suporte da amostra de modo que os sinais de PA gerados a partir de cada posição da fita preta tenham o mesmo atraso de tempo que o medido na etapa 1.4.5. Desligue o laser e conecte o UT aos dois amplificadores. 2. Preparação da amostra Fatia cerebral do rato FFPE Sacrifique um rato com uma overdose de anestesia. Em seguida, colher o cérebro do rato seguindo o protocolo descrito na referência18. Conserte o cérebro colhido em formalina tamponada 10% neutra por 24 h. Processe o cérebro fixo por desidratação com álcool classificado, limpando com xileno e incorporando com parafina como descrito na referência19.NOTA: Processe a amostra em um capô de fumaça. Corte o cérebro embutido em fatias finas (5 μm de espessura) usando um microtome. Coloque as fatias de amostra em lâminas de quartzo. Seque as lâminas em um forno a 60 °C por 1h. Desparafinar as seções usando um agente de compensação (ver Tabela de Materiais), que remove a parafina para evitar sinais de fundo elevados, pois a parafina é altamente absorvente com excitação UV.NOTA: Processe a amostra em um capô de fumaça. Fatia cerebral de rato fresco Sacrifique um rato com uma overdose de anestesia. Em seguida, colhe o cérebro do rato seguindo o protocolo estabelecido na referência18. Lave o cérebro do rato com soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) para remover o sangue. Corte uma fatia da amostra cerebral (~5 mm de espessura) à mão e depois lave a amostra com PBS para remover o sangue na seção transversal. 3. Procedimentos experimentais Colocação da amostra Prepare um tanque de amostra feito em laboratório com uma membrana transparente UV (polietileno, ∼ 10 μm de espessura). Adicione uma gota de água à membrana e coloque a amostra biológica no reservatório de amostras para cobrir a água. No caso da amostra de fatia FFPE, use fita adesiva para fixar o deslizamento de vidro na membrana. Coloque o tanque de amostra contendo amostra no suporte da amostra, garantindo cobrir o orifício vazio do suporte da amostra. Ajuste o laser UV no modo de gatilho externo. Usando nosso programa LabVIEW construído em laboratório (ver Tabela de Materiais), defina os parâmetros de digitalização da seguinte forma. Definir a taxa de repetição do laser para 55 kHz; definir o sinal edo driver GM para triangular e a faixa de tensão de condução para 0,018 V (representando ±0,018 V; fator de escala: 1 V/°). Ajuste GMnum para 22 e dy para 2 para que, após cada 22 gatilhos a laser, o GM termine um quarto do período de varredura, e o motor do eixo y mova um tamanho de passo de 0,3125 μm. Ajuste dx para 192 para que quando o motor do eixo y atinja a posição predefinida (por exemplo, 5 mm), o motor x-eixo move um tamanho de passo de 30 μm.NOTA: O menor tamanho de etapa incremental está definido para 0,15625 μm para os motores x-e-eixo y. Portanto, quando dy = 2, o tamanho do passo equivale a 0,15625 x 2 = 0,3125 μm, e quando dx = 192, o tamanho do passo equivale a 0,15625 x 192 = 30 μm. Para escanear toda a área de 5 x 5 mm2, o motor x-eixo moverá 5000 μm /30 μm = 167 vezes, o que significa que 167 sub-imagens seriam costuradas para obter uma imagem inteira. Consulte a Figura 2 para obter a trajetória de digitalização do sistema UV-PAM. Inicie a varredura de ensaio em uma pequena região definindo o número de passos móveis dos motores x e y-axis (xn = 10 e yn = 1000). Ajuste o estágio manual do eixo z para colocar a amostra no plano focal para obter sinais máximos de AF. Mova os motores x e y-axis para o ponto de partida desejado, defina a região de digitalização definindo os valores xn e yn e, em seguida, inicie o programa de aquisição de imagens (ver Tabela de Materiais). Após a aquisição da imagem, desligue o laser, remova o suporte da amostra e armazene as amostras biológicas. Para tecidos biológicos frescos, armazene as amostras em formalina tamponada 10% neutra. Para as fatias cerebrais do mouse FFPE, colori a mancha com H&E seguindo o protocolo indicado na referência20 para obter as imagens correspondentes manchadas de H&E. Use os sinais pa coletados para reconstruir a imagem de projeção de amplitude máxima usando um algoritmo de processamento de imagem construído em laboratório (ver Tabela de Materiais).