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Bioengineering

Microscopía fotoacústica ultravioleta de alta velocidad para imágenes histológicas con tinción virtual asistida por deep learning

Published: April 28, 2022
doi:
10.3791/63649
, , , ,
1Translational and Advanced Bioimaging Laboratory, Department of Chemical and Biological Engineering,Hong Kong University of Science and Technology

Summary

Se demuestra un microscopio fotoacústico ultravioleta abierto y de alta velocidad que puede proporcionar imágenes histológicas intraoperatorias para el análisis del margen quirúrgico, incluida la configuración del sistema, la alineación óptica, la preparación de muestras y los procedimientos experimentales.

Abstract

El análisis de margen quirúrgico (AME), un procedimiento esencial para confirmar la escisión completa de tejido canceroso en la cirugía de resección tumoral, requiere herramientas de diagnóstico intraoperatorias para evitar cirugías repetidas debido a un margen quirúrgico positivo. Recientemente, aprovechando la alta absorción óptica intrínseca de ADN/ARN a una longitud de onda de 266 nm, se ha desarrollado la microscopía fotoacústica ultravioleta (UV-PAM) para proporcionar imágenes histológicas de alta resolución sin etiquetado, mostrando una gran promesa como herramienta intraoperatoria para la AME. Para permitir el desarrollo de UV-PAM para SMA, aquí se presenta un sistema UV-PAM de alta velocidad y descapotable, que se puede operar de manera similar a las microscopías ópticas convencionales. El sistema UV-PAM proporciona una alta resolución lateral de 1,2 μm y una alta velocidad de imagen de 55 kHz de velocidad de línea A con escaneo de espejo galvanómetro de un eje. Además, para garantizar que las imágenes UV-PAM puedan ser fácilmente interpretadas por patólogos sin capacitación adicional, las imágenes UV-PAM originales en escala de grises están virtualmente teñidas por un algoritmo de aprendizaje profundo para imitar las imágenes estándar teñidas de hematoxilina y eosina, lo que permite un análisis histológico sin entrenamiento. Las imágenes de corte cerebral de ratón se realizan para demostrar el alto rendimiento del sistema UV-PAM abierto, lo que ilustra su gran potencial para las aplicaciones de AME.

Introduction

El análisis quirúrgico del margen (AME), que requiere un examen de muestras de tejido bajo un microscopio, es un procedimiento esencial para determinar si todas las células cancerosas se extraen del cuerpo de un paciente en una cirugía de resección1. Por lo tanto, un microscopio que pueda proporcionar rápidamente imágenes histológicas es de vital importancia para que la AME evite cirugías repetidas causadas por la extirpación incompleta de las células cancerosas. Sin embargo, de acuerdo con el método estándar de oro actual basado en microscopía óptica de campo brillante, se requiere que el tejido extirpado se fije en formalina, se incruste en parafina, se seccione en rodajas delgadas (4-7 μm) y luego se tiñe con hematoxilina y eosina (H & E) antes de la obtención de imágenes, lo que lleva mucho tiempo (3-7 días) y es laborioso 2,3 . Una sección congelada es una alternativa rápida para la AME al congelar, cortar y teñir rápidamente el tejido, lo que puede proporcionar imágenes histológicas en 20-30 min4. Sin embargo, las características histológicas a menudo están distorsionadas y requieren un entrenamiento hábil, lo que dificulta la aplicabilidad de la técnica a múltiples tipos de órganos5.

Se han desarrollado técnicas de microscopía óptica que pueden proporcionar imágenes celulares sin o con unos pocos pasos de procesamiento de tejidos para la AME. Sin embargo, cada uno de ellos sufre de diferentes problemas. Por ejemplo, la tomografía de coherencia óptica6 y la microscopía de reflectancia confocal7 sufren de baja especificidad debido a su bajo contraste de dispersión intrínseca. Aunque la microscopía con excitación de superficie ultravioleta8 y microscopíade lámina de luz 9 pueden proporcionar imágenes de alta resolución y alto contraste para la AME, el procedimiento de tinción tóxica y volátil generalmente no se puede realizar en una sala de operaciones, lo que prolonga el tiempo de respuesta. La microscopía multifotónica10 y la microscopía Raman estimulada11 pueden proporcionar información rica para la AME. Sin embargo, el alto costo de los láseres ultrarrápidos requeridos que se utilizan para generar efectos no lineales impide su amplia aplicabilidad.

Recientemente, aprovechando la absorción óptica intrínseca, se ha desarrollado la microscopía fotoacústica ultravioleta sin etiquetas (UV-PAM) para proporcionar imágenes histológicas de alta resolución12. En UV-PAM, la energía de los fotones de la luz UV de excitación (por ejemplo, 266 nm) es absorbida primero por el ADN/ARN en los núcleos celulares13 y luego convertida en calor, induciendo la emisión de ondas acústicas a través de la expansión termoelástica14. Al detectar las ondas acústicas generadas, se pueden obtener imágenes BIDIMENSIONALES (2D) UV-PAM de los núcleos celulares a través de la proyección de máxima amplitud de las señales acústicas, proporcionando información histológica para SMA. Para permitir las aplicaciones clínicas de UV-PAM, se ha desarrollado un UV-PAM de alta velocidad basado en el escaneo de espejos galvanómetros para proporcionar imágenes histológicas para una muestra de biopsia cerebral (5 mm x 5 mm) en 18 min, mostrando un gran potencial en aplicaciones sensibles al tiempo15. Para validar aún más la posibilidad de UV-PAM para imágenes de tejidos gruesos, se propuso un sistema UV-PAM en modo de reflexión con un escáner de sistemas microelectromecánicos impermeable de un eje, demostrando con éxito el examen histopatológico intraoperatorio de tejidos humanos de colon y hígado16. Dado que la imagen UV-PAM original está en escala de grises, mientras que la imagen teñida de H&E estándar de oro está en colores rosa y púrpura, es difícil para los patólogos interpretar las imágenes UV-PAM directamente. Para abordar este problema, se propuso un algoritmo de aprendizaje profundo para transferir imágenes UV-PAM en escala de grises a imágenes virtuales teñidas de H&E casi en tiempo real para que los patólogos puedan comprender las imágenes sin ningún entrenamiento adicional17.

Este trabajo informa de un sistema UV-PAM abierto y de alta velocidad que se puede operar de manera similar a las microscopías ópticas convencionales, proporcionando imágenes histológicas originales en escala de grises e imágenes virtualmente teñidas asistidas por un algoritmo de aprendizaje profundo. El sistema UV-PAM toma imágenes de una rebanada de cerebro de ratón fijada en formalina e incrustada en parafina (FFPE) para demostrar la similitud entre nuestras imágenes UV-PAM prácticamente teñidas y las imágenes estándar teñidas de H&E, mostrando su potencial para aplicaciones de AME.

Protocol

Todos los experimentos con animales realizados en este trabajo están aprobados por el Comité de Ética Animal de la Universidad de Ciencia y Tecnología de Hong Kong. 1. Sistema UV-PAM descapotable (Figura 1) Iluminación óptica Utilice un láser de estado sólido bombeado por diodo Q-switch (longitud de onda de 266 nm) como fuente de excitación. Utilice dos lentes convexas para expandir el rayo láser y coloque un agujero de alfiler cerca del punto focal de la primera lente convexa para realizar el filtrado espacial. Refleja el rayo láser hacia arriba usando un espejo galvanómetro 1D (1D GM). Use una lente objetiva para enfocar el rayo láser y pasar a través del centro de un transductor ultrasónico (UT) en forma de anillo antes de enfocarse firmemente en una muestra. Detección ultrasónica Use una UT enfocada en forma de anillo para detectar ondas ultrasónicas. Los diámetros interno y externo del área activa utular son de 3 mm y 6 mm, respectivamente. Distancia focal: 6,3 mm; frecuencia central: 40 MHz; -Ancho de banda de -6 dB: 84%. Fije el UT en un tanque de agua hecho en laboratorio con una ventana ópticamente transparente en la parte inferior, cubierta por una delgada cubierta de cuarzo para permitir el paso de la luz UV. Asegúrese de que el área activa de la UT esté orientada hacia arriba. Conecte el tanque de agua a una etapa manual de dos ejes para controlar la posición lateral de la UT. Encienda el láser UV, ajuste la posición de la UT para permitir que el rayo láser pase desde el centro de la UT. Apague el láser UV. Luego, llene el tanque de agua con agua desionizada para sumergir completamente la UT. Conecte la salida del UT a dos amplificadores (ganancia total = 56 dB) y conecte la salida del segundo amplificador a una tarjeta de adquisición de datos (DAQ). Conecte un soporte de muestra a una etapa manual del eje Z que esté conectada a etapas xy-motorizadas. El portamuestras tiene un orificio vacío que permite el paso de la luz UV. Coloque cuatro piezas de cinta adhesiva de doble cara que rodean el agujero. Alineación del sistema Coloque la cinta negra en un portaobjetos de vidrio y coloque el portaobjetos de vidrio para cubrir el orificio del soporte de la muestra, con la cinta negra hacia abajo. Presione la diapositiva de vidrio para asegurarse de que está fijada en el soporte de la muestra. Luego, baje el soporte de muestra para sumergir el portaobjetos de vidrio en el agua. Desconecte la UT en forma de anillo y los amplificadores, conecte la UT al pulser/receptor y conecte la salida del pulser/receptor a un osciloscopio. Opere el pulser/receptor en el modo Pulse-Echo. Ajuste la amplitud del pulso y la ganancia del pulser/receptor a 6 y 20 dB, respectivamente. Habilite el pulser/receptor y ajuste la posición z del soporte de la muestra para encontrar la posición del plano focal acústico donde las señales ultrasónicas son máximas. Cambie el pulser/receptor al modo de transmisión y ajuste la ganancia a 60 dB. Habilite la salida láser. Ajuste la posición z de la lente del objetivo para maximizar las señales de PA que mide el osciloscopio. Ajuste la posición lateral de la UT en forma de anillo para que la señal de PA generada sea simétrica y máxima, lo que representa que los focos ópticos y acústicos están coalineados en el plano lateral. Luego, ajuste la posición z del soporte de muestra para maximizar las señales de PA. Repita los pasos 1.4.3 y 1.4.4 para optimizar tanto la simetría como la amplitud de las señales de PA. Registre el retardo de tiempo (es decir, el tiempo que tardan las ondas de PA en llegar a la UT) en el osciloscopio cuando las señales de PA están optimizadas. Mueva el soporte de muestra para obtener imágenes de diferentes posiciones de la cinta negra. Ajuste la planitud del soporte de la muestra de modo que las señales de PA generadas desde cada posición de la cinta negra tengan el mismo retardo de tiempo que la medida en el paso 1.4.5. Apague el láser y conecte la UT a los dos amplificadores. 2. Preparación de la muestra Corte de cerebro de ratón FFPE Sacrificar un ratón con una sobredosis de anestesia. Luego, cosechar el cerebro del ratón siguiendo el protocolo descrito en la referencia18. Fije el cerebro cosechado en formalina amortiguada neutra al 10% durante 24 h. Procese el cerebro fijo por deshidratación con alcohol graduado, limpieza con xileno e incrustación con parafina como se describe en la referencia19.NOTA: Procese la muestra en una campana extractora de humos. Corte el cerebro incrustado en rodajas delgadas (5 μm de grosor) usando un microtomo. Coloque las rodajas de muestra en diapositivas de cuarzo. Secar los portaobjetos en un horno a 60 °C durante 1 h. Desparafinar las secciones utilizando un agente de limpieza (ver Tabla de Materiales), que elimina la parafina para evitar altas señales de fondo ya que la parafina es altamente absorbente con la excitación UV.NOTA: Procese la muestra en una campana extractora de humos. Rebanada fresca de cerebro de ratón Sacrificar un ratón con una sobredosis de anestesia. Luego, recolecte el cerebro del ratón siguiendo el protocolo establecido en la referencia18. Lave el cerebro del ratón con solución salina tamponada con fosfato (PBS) para eliminar la sangre. Corte una rebanada de la muestra de cerebro (~ 5 mm de grosor) a mano y luego lave la muestra con PBS para eliminar la sangre en la sección transversal. 3. Procedimientos experimentales Colocación de muestras Prepare un tanque de muestras hecho en laboratorio con una membrana transparente UV (polietileno, ∼10 μm de espesor). Agregue una gota de agua a la membrana y luego coloque la muestra biológica en el tanque de muestra para cubrir el agua. En el caso de la muestra de rebanada FFPE, use cinta adhesiva para fijar el portaobjetos de vidrio en la membrana. Coloque el tanque de muestras que contiene la muestra en el soporte de la muestra, asegurándose de cubrir el orificio vacío del soporte de la muestra. Ajuste el láser UV al modo de disparo externo. Utilizando nuestro programa LabVIEW creado en laboratorio (consulte la Tabla de materiales), establezca los parámetros de escaneo de la siguiente manera. Ajuste la tasa de repetición láser a 55 kHz; establezca la señal tipoe del controlador GM en triangular y el rango de voltaje de conducción en 0.018 V (que representa ±0.018 V; factor de escala: 1 V / °). Ajuste GMnum a 22 y dy a 2 para que después de cada 22 disparadores láser, el GM termine una cuarta parte del período de escaneo y el motor del eje Y mueva un tamaño de paso de 0.3125 μm. Establezca dx en 192 para que cuando el motor del eje Y alcance la posición preestablecida (por ejemplo, 5 mm), el motor del eje X mueva un tamaño de paso de 30 μm.NOTA: El tamaño de paso incremental más pequeño se establece en 0,15625 μm para los motores de los ejes X e Y. Por lo tanto, cuando dy = 2, el tamaño del paso es igual a 0.15625 x 2 = 0.3125 μm, y cuando dx = 192, el tamaño del paso es igual a 0.15625 x 192 = 30 μm. Para escanear toda el área de 5 x 5 mm2, el motor del eje X se moverá 5000 μm / 30 μm = 167 veces, lo que significa que se coserían 167 subimágenes para obtener una imagen completa. Consulte la Figura 2 para conocer la trayectoria de escaneo del sistema UV-PAM. Inicie el escaneo de prueba en una región pequeña estableciendo el número de pasos móviles de los motores de los ejes X e Y (xn = 10 e yn = 1000). Ajuste la etapa manual del eje Z para colocar la muestra en el plano focal para obtener las máximas señales de PA. Mueva los motores de los ejes X e Y al punto de partida deseado, establezca la región de escaneo estableciendo los valores xn e yn y, a continuación, inicie el programa de adquisición de imágenes (consulte Tabla de materiales). Después de la adquisición de la imagen, apague el láser, retire el soporte de la muestra y almacene las muestras biológicas. Para los tejidos biológicos frescos, almacene las muestras en formalina tamponada neutra al 10%. Para las rodajas cerebrales de ratón FFPE, tinción con H&E siguiendo el protocolo establecido en la referencia20 para obtener las correspondientes imágenes teñidas de H&E. Utilice las señales de PA recogidas para reconstruir la imagen de proyección de amplitud máxima utilizando un algoritmo de procesamiento de imágenes creado en laboratorio (consulte la Tabla de materiales).

Representative Results

La Figura 1 muestra el esquema del sistema UV-PAM de alta velocidad. En esta configuración, las rutas de excitación óptica y detección ultrasónica están en el mismo lado y debajo de la muestra, formando un modo reflectante y un sistema abierto. Por lo tanto, es fácil de usar y adecuado para obtener imágenes de muestras gruesas. La Figura 2 muestra la trayectoria de escaneo del sistema UV-PAM durante la toma de imágenes. La subimagen de cada sección (por ejemplo, área de 5 mm x 30 μm) se genera primero utilizando un algoritmo de interpolación dispersa, y luego, se obtiene una imagen completa (por ejemplo, área de 5 mm x 5 mm) uniendo todas las subimágenes utilizando un algoritmo de procesamiento de imágenes personalizado (consulte la Tabla de materiales). La Figura 3A y la Figura 3B muestran las imágenes UV-PAM y H&E de una rebanada de cerebro de ratón FFPE, respectivamente, las cuales tienen un campo de visión de 5 x 5 mm2. Se puede acceder al algoritmo de procesamiento de imágenes desde Github a través del enlace proporcionado en la Tabla de materiales. El tiempo de adquisición de la imagen fue inferior a 18 min. La Figura 3C-F muestra las imágenes ampliadas de las regiones marcadas en la Figura 3A, donde los núcleos celulares individuales se pueden resolver claramente. Más importante aún, los núcleos celulares correspondientes se pueden encontrar en las imágenes teñidas de H&E estándar (Figura 3G-J), lo que muestra la alta precisión del sistema actual para imágenes celulares. Para transferir la imagen UV-PAM en escala de grises a una imagen virtual teñida de H&E, se aplicó un algoritmo de aprendizaje profundo17 (ver Tabla de materiales), que tomaría menos de 30 s para una imagen con 8000 x 8000 píxeles. Las imágenes ampliadas correspondientes se muestran en la Figura 3K-N. Las imágenes UV-PAM virtualmente teñidas proporcionan casi la misma información estructural que las imágenes teñidas de H&E, mostrando una promesa para la traducción clínica del sistema UV-PAM actual. Figura 1: El esquema del sistema UV-PAM de alta velocidad y abierto. (A) La configuración del sistema. (B) Fotografía del portamuestras y un tanque de agua que está unido a una etapa manual de dos ejes. (C) Fotografía del transductor ultrasónico en forma de anillo fijado en el tanque de agua y el tanque de muestra que cubre el orificio del portamuestras. (D) Fotografía del tanque de muestra con la membrana y la muestra que se colocaría en el portamuestras. UV: Ultravioleta; DAQ: Tarjeta de adquisición de datos; GM: Espejo galvanómetro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: La trayectoria de escaneo del sistema UV-PAM durante la toma de imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: Resultados experimentales de imágenes UV-PAM con tinción virtual basada en aprendizaje profundo. (A) Imagen UV-PAM de una rebanada de cerebro de ratón FFPE. (B) Imagen estándar teñida de H&E de la misma rebanada. Barras de escala: 1 mm. (C-F) Imágenes ampliadas de las regiones marcadas en A. (G-J) Imágenes correspondientes teñidas de H&E de las regiones marcadas en B. (K-N) Imágenes correspondientes virtualmente teñidas utilizando un algoritmo de aprendizaje profundo. Barras de escala: 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

En resumen, se ha demostrado un sistema UV-PAM abierto y de alta velocidad para imágenes histológicas. Se presentan las instrucciones detalladas sobre la configuración del sistema, la alineación óptica, la preparación de muestras y los procedimientos experimentales. Se puede acceder al programa de adquisición de imágenes desde Github a través del enlace proporcionado en la Tabla de materiales. La resolución lateral del sistema actual es de ~1,2 μm que se ha medido experimentalmente en una publicación reciente21. Se tomó una imagen de una rebanada de cerebro de ratón para demostrar que el sistema actual puede obtener una imagen histológica dentro de los 18 minutos para un área de 5 x 5 mm2, que es un tamaño típico de biopsia cerebral22. Aunque la imagen original está en escala de grises, con la ayuda de una herramienta de tinción virtual digital habilitada por un algoritmo de aprendizaje profundo, el sistema actual puede proporcionar imágenes virtualmente teñidas casi en tiempo real, lo que garantiza una fácil adaptación para que los patólogos interpreten las imágenes. Como técnica de imagen sin etiquetas, el actual sistema UV-PAM también puede proporcionar imágenes histológicas para muestras de tejido fresco sin procesar. En una publicación anterior se han demostrado más ejemplos (incluidas muestras de tejido fresco y de sección congelada)17. Los resultados experimentales muestran el alto potencial del actual sistema UV-PAM asistido por aprendizaje profundo en aplicaciones SMA.

Una de las ventajas del sistema UV-PAM es que el sistema se implementa en modo de reflexión, lo que permite obtener imágenes de tejidos gruesos. Además, el sistema UV-PAM abierto permite colocar la muestra en la ventana de escaneo (la membrana del tanque de muestra), que tiene un funcionamiento similar al de las microscopías ópticas tradicionales. Por lo tanto, este sistema es más fácil de usar que otros sistemas que requieren que las muestras sean intercaladas por dos membranas11,14. Además, mediante el uso de un GM 1D con un láser UV de alta tasa de repetición, el sistema UV-PAM actual puede lograr una alta velocidad de imagen con una mayor rentabilidad en comparación con el sistema que utiliza excitación multifocal23.

Actualmente, la velocidad de imagen está limitada principalmente por la tasa de repetición del presupuesto de láser y fotones. Con un láser que tiene una alta tasa de repetición y alta energía de pulso, el tiempo de imagen se puede acortar aún más. Otra limitación del sistema es que la muestra solo se puede ajustar aproximadamente al plano focal de la lente del objetivo encontrando las señales de PA máximas, en lugar de mostrar una imagen en tiempo real para que los usuarios visualicen si la muestra está enfocada. Para mostrar una imagen casi en tiempo real, se puede aplicar 2D GM.

Hay dos etapas críticas en el protocolo: a) el requerimiento confocal de los focos ópticos y acústicos debe optimizarse para lograr una alta sensibilidad de detección; b) el rango de escaneo del GM en el eje x debe ser más pequeño que el punto focal acústico de la UT en forma de anillo para mantener una sensibilidad de detección alta similar (en la configuración actual, el rango de escaneo es de ~ 30 μm ±15 μm). De lo contrario, los efectos obvios de viñeteado alrededor de los bordes ocurrirían cuando se unen varias subimágenes para obtener una imagen completa.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores desean agradecer el apoyo financiero de la Comisión de Innovación y Tecnología de Hong Kong (ITS/036/19).

Materials

Alcohol Sigma Aldrich PHR1373 Sample dehydration
Amplifier Mini Circuit ZFL-500LN-BNC+ Ultrasonic signal amplification
Controller National Instruments NI myRIO System controller
Data acquisition card Alazar Technologies ATS9350 Ultrasonic signal collection
Deep-learning algorithm For transfering the grayscale UV-PAM image to a virtual H&E-stained image; https://github.com/TABLAB-HKUST/Deep-PAM
Formalin Sigma Aldrich R04586 Sample fixation
H&E staining kit Abcam ab245880 Sample staining
Histo-Clear II National Diagnostics HS-202 Sample deparaffinization
Image acquisition program National Instruments LabVIEW Lab-built program using LabVIEW; https://github.com/TABLAB-HKUST/LabVIEW-program-for-UV-PAM
Image processing algorithm Mathworks MATLAB Lab-built algorithm using MATLAB; https://github.com/TABLAB-HKUST/ImageRec_GM-UVPAM
Kinematic platform mounts Thorlabs KM200B Adjust the sample to be flat
Membrane Glad Cling wrap Sandwiched in sample tank
Microscope objective lens Thorlabs LMU- 5X-NUV Objective lens
Motorized stages Physik Instrumente L-509.10SD00 Scanning stages
One-dimensional galvanometer mirror Thorlabs GVS411 Fast scanning mirror
Oscilloscope RIGOL Technologies DS1102E Ultrasonic signal readout
Phosphate-buffered saline Sigma Aldrich P3813 Sample washing
Pinhole Edmund Optics #59–257 Spatial filtering
Plano convex lens Thorlabs LA-4600-UV Focusing lens
Plano convex lens Thorlabs LA-4663-UV Collimating lens
Pulser/receiver Imaginant DPR300 Pulse echo amplifier
Q-switch diode-pumped solid-state laser Bright Solutions WEDGE HF 266 nm 266-nm laser
Ring-shaped ultrasonic transducer University of Southern California Ultrasonic signal detection
Sample holder Lab-made Hold the sample tank
Sample tank Lab-made Hold biological samples
Single-axis Z-translational stage Thorlabs PT1 Manual stage
Two-axis manual stage Thorlabs LX20 Manual stage
Water tank Lab-made Ultrasonic signal transmission
Xylene Sigma Aldrich XX0060 Sample clearing
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References

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Li, X., Kang, L., Lo, C. T. K., Tsang, V. T. C., Wong, T. T. W. High-Speed Ultraviolet Photoacoustic Microscopy for Histological Imaging with Virtual-Staining assisted by Deep Learning. J. Vis. Exp. (182), e63649, doi:10.3791/63649 (2022).
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