ディープラーニングによる仮想染色による組織学的イメージングのための高速紫外線光音響顕微鏡

この研究で実施されたすべての動物実験は、香港科技大学の動物倫理委員会によって承認されています。 1. オープントップUV-PAMシステム(図1) 光学照明 励起源としてQスイッチダイオード励起固体レーザ(波長266nm)を使用してください。 2つの凸レンズを使用してレーザービームを展開し、最初の凸レンズの焦点の近くにピンホールを配置して空間フィルタリングを実行します。 1Dガルバノミラー(1D GM)を使用してレーザービームを上方に反射します。 対物レンズを使用してレーザービームを集束させ、リング状の超音波探触子(UT)の中心を通過してからサンプルにしっかりと焦点を合わせます。 超音波検出 リング状の集束UTを使用して超音波を検出します。UTアクティブエリアの内径と外径は、それぞれ3mmと6mmです。焦点距離: 6.3 ミリメートル;中心周波数: 40 MHz;-6 dB 帯域幅: 84%。 UTをラボ製の水槽に固定し、下部に光学的に透明な窓があり、薄い石英のカバースリップで覆われてUV光が通過できるようにします。UT のアクティブ領域が上を向いていることを確認します。UTの横方向の位置を制御するための2軸手動ステージに水タンクを取り付けます。 UVレーザーをオンにし、UTの位置を調整して、レーザービームがUTの中心から通過できるようにします。UVレーザーをオフにします。次いで、水タンクを脱イオン水で満たし、UTを完全に浸漬する。 UTの出力を2つのアンプに接続し(合計ゲイン = 56dB)、2番目のアンプの出力をデータ・アクイジション・カード(DAQ)に接続します。 xy電動ステージに接続されたz軸手動ステージにサンプルホルダーを取り付けます。サンプルホルダーには、UV光を通過できる空の穴があります。穴を囲む両面テープを4枚取り付けます。 システムアライメント 黒いテープをスライドガラスに取り付け、黒いテープを下に向けてサンプルホルダーの穴を覆うようにスライドガラスを置きます。スライドガラスを押して、サンプルホルダーに固定されていることを確認します。その後、サンプルホルダーを下げて、スライドガラスを水に浸した。 リング状のUTとアンプを取り外し、UTをパルサー/レシーバーに接続し、パルサー/レシーバーの出力をオシロスコープに接続します。パルサー/レシーバーをパルスエコーモードで操作します。パルス振幅とパルサー/レシーバーのゲインをそれぞれ6dBと20dBに設定します。 パルサー/レシーバーを有効にし、サンプルホルダーのz位置を調整して、超音波信号が最大となる音響焦点面の位置を見つけます。 パルサー/レシーバーを送信モードに変更し、ゲインを60dBに設定します。レーザー出力を有効にします。対物レンズのZ位置を調整して、オシロスコープで測定されるPA信号を最大化します。 リング状のUTの横方向の位置を調整して、生成されたPA信号を対称かつ最大にし、光学的および音響的病巣が側方平面内で同一位置合わせされることを表す。次に、サンプルホルダのZ位置を調整して、PA信号を最大化します。 手順1.4.3と1.4.4を繰り返して、PA信号の対称性と振幅の両方を最適化します。PA信号が最適化されたときの時間遅延(すなわち、PA波がUTに到達するのにかかる時間)をオシロスコープに記録します。 サンプルホルダーを動かして、黒いテープのさまざまな位置を画像化します。黒いテープの各位置から生成されるPA信号がステップ1.4.5で測定されたものと同じ時間遅延を持つように、サンプルホルダの平坦度を調整します。 レーザーをオフにし、UTを2つのアンプに接続します。 2. サンプル調製 FFPEマウス脳スライス 麻酔の過剰摂取でマウスを犠牲にする。次いで、参考文献18に記載のプロトコールに従ってマウス脳を採取する。 収穫した脳を10%中性緩衝ホルマリンで24時間固定する。 段階的なアルコールによる脱水、キシレンによるクリア、および参考文献19に記載されているようにパラフィンによる埋め込みによって固定された脳を処理する。メモ: サンプルをヒュームフードで処理します。 ミクロトームを用いて、埋め込まれた脳を薄いスライス(厚さ5μm)にスライスする。サンプルスライスを石英スライドの上に置きます。スライドを60°Cのオーブンで1時間乾燥させる。 パラフィンがUV励起で高度に吸収されるため、高いバックグラウンド信号を避けるためにパラフィンを除去する透明化剤( 材料表を参照)を使用して切片を脱パラフィン化する。メモ: サンプルをヒュームフードで処理します。 新鮮なマウスの脳スライス 麻酔の過剰摂取でマウスを犠牲にする。次いで、参考文献18に記載されたプロトコールに従ってマウス脳を採取する。 マウス脳をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、血液を除去した。 脳サンプルのスライス(厚さ約5mm)を手で切断し、PBSでサンプルを洗浄して断面上の血液を除去した。 3. 実験手順 サンプルの配置 UV透過膜(ポリエチレン、厚さ約10μm)を備えたラボ製のサンプルタンクを用意します。膜に水滴を加え、生物学的サンプルをサンプルタンクの上に置き、水を覆います。FFPEスライスサンプルの場合は、テープを使用してスライドガラスをメンブレンに固定します。 試料含有試料タンクを試料ホルダ上に置き、試料ホルダの空孔を覆うようにする。 UVレーザーを外部トリガーモードに設定します。ラボで作成したLabVIEWプログラム( 材料表を参照)を使用して、スキャンパラメータを次のように設定します。 レーザーの繰り返しレートを 55 kHz に設定します。GMドライバの 信号typeを 三角形 に設定し、駆動電圧 範囲 を0.018Vに設定します(±0.018V、スケールファクタ:1V/°を表す)。 GMnum を 22 に設定し、 dy を 2 に設定して、22 回のレーザー トリガーごとに GM がスキャン期間の 4 分の 1 を終了し、y 軸モーターが 0.3125 μm のステップ サイズを移動するようにします。 dx を 192 に設定して、y 軸モーターがプリセット位置 (例えば、5 mm) に達すると、x 軸モーターが 30 μm のステップ サイズで移動するようにします。メモ: 最小増分ステップサイズは、X 軸モーターと Y 軸モーターの両方で 0.15625 μm に設定されます。したがって、dy = 2 の場合、ステップ サイズは 0.15625 x 2 = 0.3125 μm に等しく、dx = 192 のとき、ステップ サイズは 0.15625 x 192 = 30 μm になります。5 x 5 mm2の全領域をスキャンするには、x軸モーターが5000 μm / 30 μm = 167回移動するため、167枚のサブ画像をステッチして画像全体を取得します。UV-PAMシステムのスキャン軌道については、 図2 を参照してください。 x軸モーターとY軸モーターの移動ステップ数(xn = 10、 yn = 1000)を設定して、小さな領域でトライアルスキャンを開始します。z軸手動ステージを調整して、サンプルを焦点面に配置して、最大のPA信号を取得します。 x軸モーターとy軸モーターの両方を目的の開始点に移動し、 xn 値と yn 値を設定してスキャン領域を設定し、画像取得プログラムを起動します( 材料表を参照)。 画像取得後、レーザーをオフにし、サンプルホルダーを取り外し、生物学的サンプルを保管します。 新鮮な生物学的組織の場合、サンプルを10%中性緩衝ホルマリンで保存する。 FFPEマウス脳スライスについて、参考文献20 に記載されたプロトコルに従ってH&Eで染色し、対応するH&E染色画像を得る。 収集されたPA信号を使用して、ラボで構築された画像処理アルゴリズムを使用して最大振幅投影画像を再構築します( 材料表を参照)。